Gene silencing of Col1α1 by RNAi in rat myocardium fibroblasts Gene silencing of Col1α1 by RNAi in rat myocardium fibroblasts

Sıçan miyokard fibroblastlarında Col1α1’in RNAi tarafından gen susturulması

Abstract

Objective: The collagen type I alpha 1 (Col1α1) not onlyacts as a scaffold for the cell matrix, but also is involved inmyocardial fibrosis. The purpose of this study is to screenan efficient shRNA specific to rat Col1α1 gene.Methods: The shRNA expression plasmids targetingCol1α1 were constructed and their knockdown efficiencywas examined by qPCR and Western blot.Results: Three shRNA expression plasmids targetingCol1α1 were successfully constructed, as suggested byanalysis of restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The Col1α1 shRNA-expressing plasmids were thentransfected into rat cardiac fibroblasts with high efficiency.The qPCR and Western blotting results demonstrated thatCol1α1 expression at both mRNA and protein level was significantly inhibited (p < 0.05) in shRNA-transfected cellscompared to scrambled shRNA-transfected cells.Conclusion: A Col1α1-specific shRNA with high efficiencyof gene silencing is successfully obtained. The construction of Col1α1 shRNA-expressing plasmid lays the foundation for the further studies on the role of Col1α1 gene inmyocardial fibrosis.

Özet

Amaç: Kollajen tip I alfa 1 (Col1α1) sadece hücre matrisi için bir iskele görevi görmez, aynı zamanda miyokard fibrozisinde rol oynar. Bu çalışmanın amacı, sıçan Col1α1 genine özgü etkili bir shRNA’yı taramaktır. Yöntem: Col1α1’i hedefleyen shRNA ekspresyon plazmidleri üretildi ve nakavt verimleri qPCR ve Western blot ile incelendi. Bulgular: Restriksiyon enzimi kesimi ve DNA dizilimi analizinin gösterdiği gibi Col1α1’i hedef alan üç shRNA ekspresyon plazmidi başarıyla yapıldı. Col1α1 shRNA ifade eden plazmidler daha sonra, yüksek verimde sıçan kardiyak fibroblastlarına transfekte edildi. qPCR ve Western blot sonuçları, hem mRNA hem de protein seviyesinde Col1α1 ekspresyonunun, shRNA ile transfekte edilmiş hücrelerde, karıştırılmış shRNA ile transfekte edilmiş hücrelere kıyasla, önemli ölçüde inhibe edildiğini (p < 0.05) göstermiştir. Sonuç: Col1α1’e özgü gen susturma etkinliği yüksek bir shRNA başarıyla elde edildi. Col1α1 shRNA eksprese eden plazmidin üretimi, Col1α1 geninin miyokardiyal fibrozisteki rolü üzerine yapılacak sonraki araştırmaların temelini oluşturmaktadır