Investigation of The Efficacy of Three Different ProteinExtraction Protocols and Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization-Time of Flight Mass Spectrometry for theIdentification of Nontuberculous Mycobacteria

Tüberküloz Dışı Mikobakterilerin Tanımlanmasında Üç Farklı Protein Ekstraksiyon Protokolü ve Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyonUçuş Zamanlı Kütle Spektrometresi Etkinliğinin Araştırılması

Ahmet ARSLANTÜRK, Tuğrul HOŞBUL, Kemal TEKİN, Ali ALBAY, Hande ÖZCAN, Suphiye Nilay UÇARMAN

Abstract

There are more than 160 defined nontuberculous mycobacteria (NTM) species within Mycobacterium genus. In recent years, the number of NTM species associated with human infections and the infections caused by them have been reported at increasing rates. The identification of these species by phenotypic methods is difficult, laborious, and unlikely to obtain reliable results. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS has proven to be a good method for the identification of bacteria and yeasts in routine laboratory practices. However, Mycobacterium species differ from other bacteria by their cell wall structures, less ribosomal protein content, and slower growth rates. A standardized and efficient protein extraction protocol for MALDI-TOF MS analysis of mycobacteria is essential. The aim of our study was to investigate the efficacy of different protein extraction protocols and the MALDI-TOF MS method in the diagnosis of NTM species. A total of 73 NTM isolates, grown in both solid and liquid media and previously identified with line probe assay, were evaluated with MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics GmbH & Co. KG, Germany). Stock isolates were homogenized and decontaminated by N-Acetyl L-cysteine (NALC)/Sodium hydroxide (NaOH) method. For solid media, isolates were inoculated on Löwenstein-Jensen medium and incubated at 35˚C in a normal atmosphere. For liquid media culture, BD BACTEC MGIT 960 automated system (Becton, Dickinson, Sparks, MD, USA) was performed according to the manufacturer’s instructions. For the identification of all isolates by MALDI-TOF MS, the manufacturer’s recommended protein extraction protocol (Protocol 1) was compared with the two other protocols, using a simplified extraction procedure (Protocol 2), and freezing temperature (Protocol 3). In the liquid media analysis, the rates of the isolates identified by MALDI-TOF MS (score≥ 2.0) for Protocol 1, 2, and 3 were found as 84.93% (n= 62), 63.01% (n= 46), and 43.83% (n= 32), respectively. In the solid media analysis, the rates of the isolates with an identification score of ≥ 2.0 for the protocols with the same order were determined as 87.67% (n= 64), 52.05% (n= 38), and 31.50% (n= 23), respectively. Isolates grown in both solid and liquid media were identified in the same species level in all three protocols, regardless of the identification values and misidentification was not presented. When the reliable identification score was evaluated as ≥ 2.0 in our study, the manufacturer’s recommended MYCOEX IVD procedure was found to be the most effective method for the isolates grown in both liquid and solid media. In conclusion, MALDI-TOF MS has the potential to be a reliable, easy-to-use and fast method that can be used in routine practice for the identification of NTM species with its standardized protein extraction protocols.

Özet

Mycobacterium cinsi içerisinde tanımlanmış sayıları 160’tan fazla olan tüberküloz dışı mikobakteri (TDM) türleri yer almaktadır. Son yıllarda insan enfeksiyonlarıyla ilişkilendirilmiş TDM türleri ve bunların neden oldukları enfeksiyonlar artan oranlarda bildirilmektedir. Bu türlerin fenotipik yöntemler ile tanımlanmaları zor, zahmetli ve güvenilir sonuç alınma ihtimali düşüktür. Matriks destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon-uçuş zamanlı kütle spektrometresinin [matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)] rutin laboratuvar uygulamalarında bakteri ve mayaların tanımlanması için iyi bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Ancak Mycobacterium türleri diğer bakterilerden hücre duvar yapıları, daha az ribozomal protein içermeleri ve daha yavaş üreme hızları gibi özellikleri ile farklılık gösterirler. Mikobakterilerin MALDI-TOF MS ile analizinde standardize ve etkili bir protein ekstraksiyon protokolü gereklidir. Bu çalışmada, TDM türlerinin tanısında farklı protein ekstraksiyon protokollerinin ve MALDI-TOF MS yönteminin etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Katı ve sıvı her iki besiyerinde üretilmiş ve daha önce “line probe assay (LPA)” ile tanımlanmış toplamda 73 TDM izolatı MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics GmbH & Co. KG, Almanya) ile değerlendirilmiştir. Stok haldeki izolatlar N-Asetil L-sistein (NALC)/sodyum hidroksit (NaOH) yöntemi ile homojenize ve dekontamine edilmiştir. Katı besiyeri için izolatlar Löwenstein-Jensen besiyerine ekilmiş ve 35˚C’de normal atmosferde inkübe edilmiştir. Sıvı besiyeri kültürleri için BD BACTEC MGIT 960 otomatize sistemi (Becton, Dickinson, Sparks, MD, ABD) üreticinin talimatlarına uygun şekilde kullanılmıştır. Tüm izolatların MALDI-TOF MS ile tanımlanmaları için üreticinin önerdiği protein ekstraksiyon protokolü (Protokol 1), basitleştirilmiş ekstraksiyon işlemi (Protokol 2) ve dondurma sıcaklığı (Protokol 3) uygulayan diğer iki protokolle karşılaştırılmıştır. Sıvı besiyerlerinin analizinde Protokol 1, 2 ve 3 sırasıyla olmak üzere MALDI-TOF MS (skor≥ 2.0) tarafından tanımlanan izolatların oranları %84.93 (n= 62), %63.01 (n= 46) ve %43.83 (n= 32) olarak bulunmuştur. Katı besiyeri analizinde aynı sıradaki protokoller için tanımlanma skoru ≥ 2.0 olan izolatların oranları %87.67 (n= 64), %52.05 (n= 38) ve %31.50 (n= 23) olarak belirlenmiştir. Tanımlama değerlerine bakılmaksızın hem katı hem de sıvı besiyerinde üreyen izolatlar her üç protokolde de aynı tür dağılımında tanımlanmış ve yanlış tanımlama saptanmamıştır. Çalışmamızda güvenilir tanımlama skoru≥ 2.0 olarak değerlendirildiğinde hem sıvı hem de katı besiyerinde üreyen izolatlar için üreticinin önermiş olduğu MYCOEX IVD işlemi en etkili yöntem olarak bulunmuştur. Sonuç olarak, MALDI-TOF MS standardize edilmiş protein ekstraksiyon protokolleriyle TDM türlerinin tanımlanması için rutin uygulamada kullanılabilecek güvenilir, kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem olma potansiyeline sahiptir.