Development of a Rapid Molecular Test Format Based on Isothermal Recombinase Polymerase Amplification Technique and Lateral Flow Method for Detection of $bla_{OXA-48}$

$bla_{OXA-48}$ ’in Saptanması İçin İzotermal Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon Tekniği ve Yanal Akım Yöntemine Dayalı Hızlı Bir Moleküler Test Formatının Geliştirilmesi

Gökhan AYGÜN, Ömer KÜÇÜKBASMACI, Mert Ahmet KUŞKUCU, Asiye KARAKULLUKÇU, Kenan MİDİLLİ, Nergiz IMAMOVA

Abstract

Objective: Molecular tests are rapid, reliable tools for the detection of carbapenem resistance, but their use is limited due to their cost, requirement for well-trained technicians and highly sophisticated instrumentation. The recombinase polymerase amplification (RPA) assay, one of the isothermal amplification methods developed recently to overcome these problems, doesn’t require denaturation of target, and RPA products can be determined by probe-base detection methods even without a specific instrumentation. In this study, we aimed to develop a rapid and easily applicable molecular test format in on-site settings based on RPA technique with combination of lateral flow system for detection of blaOXA-48. Methods: Bacterial strains were obtained from the collection of hospital infection control committee. Twenty-four OXA-48-, one from each of VIM-, IMP-, NDM-, KPC-positive strains and 10 carbapenem-susceptible OXA-48-negative strains were included. Fresh cultures were suspended in 1× polymerase chain reaction (PCR) buffer, the turbidity of the suspensions were adjusted to 0.5 McFarland standard. Serial dilutions of OXA48-positive strain were prepared for evaluation of test performance and detection of lowest limit. Nucleic acid isolation was performed by boiling method. blaOXA-48-specific RPA primers and NFO probe were designed and used. RPA reactions were performed according to the manufacturer’s (TwistAmp® nfo kit, TwistDx, Cambridge, United Kingdom) instructions. Lateral flow method was used for detection of RPA products. Results: OXA-48-positive strains were detected within about 45 minutes without any need for special instruments. Lowest detection limit of the test was 10 bacteria. Neither cross-reactions nor false positivity was observed with the strains having other resistance genes or carbapenem-susceptible strains. Conclusions: Based on its simplicity and applicability without any need for special instruments, the newly-developed test can be an alternative tool to the other molecular tests (like PCR or real-time PCR) for screening of these type of enzymes for both laboratory and onsite settings.

Özet

Amaç: Karbapenemazları kodlayan genlerin saptanmasında moleküler testlerin hızlı, güvenilir ve çeşitli seçeneklerininbulunmasına karşın, maliyet, iyi eğitimli teknisyen ihtiyacı vecihaz gereksinimleri bu testlerin yaygın kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sorunları aşabilmek için son yıllarda geliştirilmiş olanizotermal amplifikasyon yöntemlerinden biri olan rekombinazpolimeraz amplifikasyon (RPA) yöntemi hedefin denatürasyonunu gerektirmez ve prob tabanlı saptama yöntemleriyle RPAürünleri özel bir cihaz olmadan bile saptanabilir. Bu çalışmada RPA tabanlı izotermal amplifikasyon yöntemiyle yanal akımsistemi birleştirilerek blaOXA-48’i saptayacak hızlı ve sahada kolayuygulanabilir bir moleküler test formatının geliştirilmesi amaçlanmıştır.Yöntemler: Bu çalışmada hastanemiz hastane infeksiyon kontrol komitesine ait karbapeneme dirençli ve duyarlı koleksiyonkökenleri (24 OXA-48-pozitif köken, birer VIM-, IMP-, NDM,KPC-pozitif köken ve 10 karbapeneme duyarlı OXA-48-negatifköken) çalışmaya dahil edildi. Kökenlerin Mueller-Hinton agarında 24 saatlik kültürleri hazırlandıktan sonra 1× polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tamponunda yoğunlukları 0.5 McFarlandstandardında olacak şekilde süspansiyonları hazırlandı. Testinperformansının ve alt saptama sınırının belirlenmesi için OXA48-pozitif kökenden de dilüsyonlar hazırlandı. Bu örneklerdenkaynatma yöntemiyle nükleik asid izolasyonu yapıldı. Örnekler,tasarlanan blaOXA-48 RPA primerleri ve NFO probuyla, RPA yöntemi kullanılarak üretici (TwistAmp® nfo kit, TwistDx, Cambridge,Birleşik Krallık) talimatları doğrultusunda amplifiye edildi. RPAürünlerinin saptanması için yanal akım yöntemi kullanıldı. Bulgular: OXA-48 enzimini kodlayan bütün kökenler yaklaşık 45 dakikada hiçbir özel cihaza gerek duymadan saptandı. Saptama altlimiti 10 bakteri olarak belirlendi. Karbapenem direncine nedenolan diğer enzimleri kodlayan kökenlerde ya da OXA-48 kodlamayan kökenlerde pozitif sinyal saptanmadı.Sonuçlar: Yeni geliştirilen bu test formatı, uygulanmasının basitolması ve özel bir cihaz gerektirmemesi dolayısıyla, bu tür enzimlerin taranması için gerek laboratuvar gerek saha koşullarında,diğer moleküler testlere (PCR, “real-time” PCR gibi) bir alternatifyöntem oluşturabilir.