Development of a Multiplex PCR Assay for the Simultaneous Detection of Echinococcus spp. in Wild Canids in the Qinghai-Tibet Plateau Area of China

Çin’in Qinghai-Tibet Platosu Bölgesindeki Yabani KöpekgillerdeEchinococcus spp.’nin Eşzamanlı Saptanması İçin Multipleks PCRYönteminin Geliştirilmesi

Abstract

Infections of Echinococcus granulosus sensu stricto, E. multilocularis and E. shiquicus are usually prevalent or coendemic in wild canids in the Qinghai-Tibet Plateau area (QTPA) of China. Thus, an efficient method for the detection of infected hosts and the identification of Echinococcus species is needed. The present work aims to establish a multiplex PCR (mPCR) method that can simultaneously detect the three main Echinococcus species mentioned above, and provide technical support for the diagnosis, prevention and control of Echinococcus infection. Three pairs of specific primers were designed for this mPCR based on the Echinococcus mitochondrial genes in GenBank, and these primers were validated by specificity and sensitivity experiments and applied for simulated coinfection samples detection and filed samples. This mPCR method was able to successfully identify both simplex and mixed target Echinococcus spp. and generate expected amplicons of different sizes for each species. The sensitivity of this mPCR method was tested with serially diluted gene recombinant plasmid, and the results showed a detection threshold of less than 103 for both species. The specificity, which was assessed against 10 other parasites, was found to be 100%. The assay was also used on 15 simulated clinical samples, and the results confirmed the high reliability of the method, indicating that the mPCR method established in this study can be used to analyze clinical samples from the QTPA. This mPCR method has potential application in rapid detection, diagnosis and broad-scale screening and is expected to become a key technology for clinical detection and environmental monitoring.

Özet

Echinococcus granulosus sensu stricto, E. multilocularis ve E. shiquicus enfeksiyonları, Çin’in Qinghai-Tibet Platosu bölgesindeki (QTPA) yabani köpekgillerde genellikle yaygın ve koendemik seyretmektedir. Bu nedenle, enfekte konakçıların tespiti ve Echinococcus türlerinin tanımlanması için etkili bir teşhis yöntemine ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, bahsedilen bu üç temel Echinococcus türünün aynı anda tespit edilmesi ve Echinococcus enfeksiyonlarının teşhisi, önlenmesi ve kontrolü için teknik destek sağlayan bir multipleks PCR (mPCR) yönteminin geliştirilmesi amaçlandı. mPCR için, Echinococcus’un GenBank’ta mevcut olan mitokondriyal genlerine bağlı olarak üç çift spesifik primer tasarlandı ve bu primerlerin özgüllük ve duyarlılıkları doğrulanarak temsili koenfeksiyon örneklerinin tespiti ve saha örnekleri için kullanıldı. mPCR yöntemi, hem bireysel hem de karma hedef Echinococcus’ları başarıyla tanımladı ve her tür için farklı boyutlarda beklenen amplikonlar oluşturdu. mPCR yönteminin duyarlılığı, seyreltilmiş gen rekombinant plazmidi ile test edildi ve her iki grup için 103 ’ten daha düşük bir saptama eşik değeri gösterdi. Diğer 10 parazite karşı değerlendirilerek, yöntemin spesifitesi %100 saptandı. mPCR yöntemi ayrıca temsili 15 klinik örnekte test edildi ve geliştirilen bu yönteminin QTPA’da klinik örneklerin analizinde kullanılabilecek yüksek güvenilirliğe sahip olduğu doğrulandı. Geliştirilen bu mPCR yönteminin, hızlı tespit, teşhis ve geniş ölçekli tarama çalışmalarında potansiyelinin olduğu saptanmıştır ve böylelikle klinik tespit ve çevresel izleme için kilit bir teknoloji olması beklenmektedir.