Importance of the leukocyte / neutrophil count in diagnostik tests for fungal infection in immunsuppressed patients

İmmunsuprese hastalarda mantar infeksiyonları tanı testlerinde lökosit / nötrofil sayısının önemi

Abstract

Fungal infections are commonly seen in immunsuppressed patients such as patients with hematological malignancies and transplantation patients. In further stages of infection most of the organs are involved such as lung, bronchi and heart and patients may die in a short period. This study was done in University of Wales College of Medicine Department of Microbiology in England. Fungal infections are suspected in immunsuppressed patients who have low leukocyte count, neutropenia and persistent fever over 380C. For this reason in our study relationship between fungal infections and leukocyte and neutrophil count was investigated. In patients who are not neutropenic and whose of leukocyte count is elevated, the determination of this infection and whether low leukocyte count may cause false negativity or not are investigated. For this reason blood samples of different leukocyte counts are examined. By using A.fumigatus species produced by incubation for 72 hours at 3O0C fungus suspension series of ICH CFU/ml were prepared in to blood samples. DNA isolation from these blood samples was done by Qiagen kit. Sequence analysis of the positive samples (fungal DNA) was done following PCR. They were investigated whether they contained genetic material from A.fumigatus or not and DNA quantitation by Real-Time PCR was done. As a result of PCR performed on a group of 50 patients who are not neutropenic and have fever over 380C and at risk of fungal infections, Aspergillus and Candida infections was observed in four patients. PCR results were analyzed by sequencing for discriminating Aspergillus and Candida infections. All sample results were found negative by mycological culture. When the results were interpreted there was no difference betweert classical PCR and Real-Time PCR product bands in agarose gel. In quantitative Real-Time PCR results, every sample gave results similar to standards of 104 CFU/ml values, which was used in the test. All of the blood samples, which have high and low leukocyte/neutrophil count, were found positive in our tests. This condition shows that the tests gave reliable results and leukocyte/neutrophil count did not affect test results. Considering Aspergillus and Candida infection positivities that we have found in non-neutropenic patients by using molecular biological methods; for immunsuppressed patients, before neutropenic condition is established, blood samples of the patients should be tested by reliable methods. As a result, in early diagnosis of fungal infections, like classical PCR, Real-Time PCR was found to be valuable as a reliable early diagnostic test.

Özet

Mantar infeksiyonları özellikle hematolojik maligniteli hastalar ve transplantasyon hastaları gibi immunsuprese hastalarda yaygın olarak görülmektedir. İnfeksiyonun ileri evrelerinde akciğer, bronşlar ve kalp dahil birçok organ hızla tutularak, hastaların kısa sürede kaybedilmeleri söz konusudur. Bu çalışma İngiltere'de Wales Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji bölümünde yapılmıştır. İmmunsuprese hastalarda öncelikli olarak düşük lökosit sayısı, nötropeni tablosu ve kalıcı >38°C ateşli olan olgularda mantar infeksiyonlarından şüphe edilmektedir. Bu nedenle çalışmamızda mantar infeksiyonlarının, lökosit ve nötrofil sayısı ile ilişkisini; hem nötropenik olmayan ve lökosit sayısı yüksek olan hastalarda bu İnfeksiyonun tesbit edilip edilemeyeceği, hem de lökosit sayısı azlığının yanlış negatifliğe yol açıp açmadığı araştırılmıştır. Bu nedenle, değişik oranlarda lökosit sayısına sahip kan örnekleri incelenmiştir. 30°C'de 72 saat inkübe ederek ürettiğimiz Aspergillus fumigatus susu kullanılarak, kan örnekleri içine mililitrede 104 CFU (Colony Forming Unit) olacak şekilde mantar süspansiyon serileri hazırlanmış; hazırlanan bu kan örneklerinden DNA izolasyonu Qiagen kitiyle yapılmıştır. Daha sonra gerçekleştirilen PCR'ı takiben mantar DNA'ları içerdiği belirlenen örneklerin seka ns analizleri yapılarak A.fumigatus'a ait genetik materyal içerip içermedikleri araştırılmış ayrıca Real-time PCR ile DNA miktar tayinleri yapılmıştır. Nötropenik olmayan, >38°C ateşli ve mantar infeksiyonları açısından risk grubunda bulunan 50 kişilik hasta grubuna yapılan PCR sonucunda dört hastada, Aspergillus ve Candida infeksiyonları saptanmıştır. PCR sonuçları sekanslama yapılarak analiz edildiğinde, Aspergillus ve Candida infeksiyonları ayrımı yapılabilmiştir. Aynı hasta örneklerine yapılan mikolojik kültür sonuçları negatif bulunmuştur. Sonuçlar değerlendirildiğinde, agaroz jelde klasik PCR ve Real-time PCR ürünleri bantları arasında bir farklılık görülmemiştir. Ayrıca kantitatif Real-time PCR sonuçlarında, her örneğin testte kullanılan standartlardan olan l O4 CFU/ml'lik değerlere yakın düzeylerde sonuç verdiği bulunmuştur. Böylece yüksek ve düşük lökosit/nötrofil sayısına sahip kan örneklerinin tamamı, yaptığımız testlerde pozitif olarak bulunmuştur. Bu durum testlerin güvenilir sonuçlar verdiğini ve lökosit/nötrofil sayısının test sonuçlarını etkilemediğini göstermektedir. Moleküler biyolojik yöntemler uygulanarak nötropenik olmayan hastalarda belirlenen Aspergillus ve Candida infeksiyonları göz önüne alındığında; immunsuprese hastalar için, mantar infeksiyonu varlığını düşündürecek klinik bulgulardan biri olan, nötropeni durumu oluşmadan, hasta örneklerinin güvenilir yöntemlerle test edilmesi gerektiği saptanmıştır. Ayrıca mantar infeksiyonları erken tanısında klasik PCR gibi Real-time PCR'ında güvenilir erken tanı testi olarak kullanılabileceği anlaşılmıştır.