Comparative evaluation of alternative methods for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi

Filamentöz mantarların antifungal duyarlılık testlerinde yöntemlerin karşılaştırılması

Abstract

Fluconazole and amphotericin B susceptibilities of four filamentous fungi isolates were assessed by macrodilution, microdilution and colorimetric microdilution assays. In the colorimetric assay the results were evaluated by a yellow colored tetrazolium salt, MTT, which is reduced to purple formazan by cellular dehydrogenases. The macrodilution and microdilution assays were performed according to NCCLS studies that were designed to provide standard guidelines. In the macro and conventional microdilution methods, the results were evaluated by visually comparing the growth in each test tube or well with that of the growth control at the end of a 48 hrs. incubation period and the concentration which caused a 75 % reduction in growth was recorded as the MIC value. In the colorimetric microdilution assay. MTT was added to the wells and the resultant color was assessed at a wavelength of 550 nm. The percentage of viable cells were determined by the relative optic density (OD) of test wells as compared to the OD of the growth control wells. The agreement between the results of different assays were 87.5 % for colorimetric micro and macrodilution assays, 75.0 % for colorimetric and conventional microdilution assays, 67.5 % for macro and conventional microdilution assays. In conclusion, MTT-microdilution method which possesses the advantages of microdilution assays such as speed, automation and cost-effectiveness, could be used to get objective and quantitative antifungal susceptibility results for filamentous fungi.

Özet

Klinik örneklerden izole ettiğimiz dört filamentöz fungus susu kullanılarak bunların flukonazol ve amfoterisin B'ye duyarlılığı makrodilüsyon, mikrodilüsyon ve kolorimetrik mikrodilüsyon yöntemleri ile incelendi. Kolorimetrik yöntemde sonuçların değerlendirilmesinde, canlı hücreler tarafından sarı renkten mor renkli formazana indirgenen bir tetrazolyum tuzu, MTT boyası kullanıldı. Makrodilüsyon ve her iki mikrodilüsyon yönteminin uygulanmasında, NCCLS'ce uygulanan ön çalışmalar temel olarak alındı 48 saatlik inkübasyon sonunda, makro ve mikrodilüsyon tekniklerinde, test tüpleri ve kuyucuklarının bulanıklığı, üreme kontrolünün bulanıklığı ile görsel olarak kıyaslandı ve üremeyi % 75 oranında inhibe eden en düşük konsantrasyon MlK değeri olarak saptandı. Kolorimetrik mikrodilüsyon yönteminde ise, kuyucuklara MTT boyası eklenerek oluşan renk 550 nm. dalga boyunda değerlendirildi. Kontrol ile test kuyucuklarının optik dansiteleri oranlanarak canlılık yüzdesi saptandı. Yöntemler arasındaki uyum oranı, kolorimetrik mikrodilüsyon ve makrodilüsyon yöntemleri için % 87.5, her iki mikrodilüsyon yöntemi için % 75.0, makro ve mikrodilüsyon yöntemleri için ise % 67.5 idi. Sonuç olarak, mikrodilüsyon yöntemlerinin hız, hesaplılık, otomatizasyon gibi özelliklerini taşıyan MTT-mikrodilüsyon yöntemi, filamentöz fungusların duyarlılık testlerinde objektif ve kantitatif bir değerlendirme yapılması amacı ile kullanılabilir.