Knock-Out of Receptor-Interacting Serine/Threonine Kinase 4 (RIPK4) Induces De-Differentiation Process in Keratinocytes

Reseptörle Etkileşen Serin/Treonin Kinaz 4 (RIPK4)’ün Keratinosıtlerde Yok Edilmesi Farklılaşma Sürecini Geriye Döndürüyor

Abstract

Objective: Self-renewal of the skin is provided by progenitor keratinocytes that are localized tobasal layer. The ones that commit to differentiate start to migrate upward to form the suprabasallayers of the epidermis. Receptor interacting serine/threonine kinase 4 (RIPK4) is is important forthe growth and differentiation of the skin. The aim of this study is to analyze the effect of depletionof RIPK4 on differentiation status of keratinocytes.Materials and Methods: RIPK4 knocked-out HaCaT (RIPK4 KO) keratinocytes were used in theexperiments. Undifferentiated basal-like state and differentiated HaCaT cells were included fordifferentiation status comparisons. The morphology of the cells was analyzed by microscope. Thelevels of the RIPK4 protein were determined with western blot. To follow the growth rates, the cellswere counted for 4 days. For transfection efficiency analysis, the cells were transfected with βgalactosidase expressing plasmids. The levels of differentiation-specific markers were determinedby real-time-PCR.Results Morphologically RIPK4 KO cells were different from HaCaT cells which show the tendencyto grow in cell clusters. RIPK4 KO cells showed resemblance to undifferentiated basal-like statecells which were more rounded and scattered. Both RIPK4 KO and basal-like state cells had lowerRIPK4 protein than HaCaT cells. In parallel with similarity to undifferentiated cell morphology,RIPK4 KO cells were more proliferative, showed higher transfection efficiency and expressed lowerlevels of keratinocyte differentiation markers compared to HaCaT cells.Conclusion: The results showed that stable depletion of RIPK4 induces the de-differentiationprocess in keratinocytes.

Özet

Amaç: Derinin kendini yenilemesi bazal katmanda yerleşik öncül keratinositlerle sağlanır. Farklılaşacak olan hücreler yukarı doğru göç ederek epidermisin üst katmanlarını oluşturur. Reseptörle etkileşen serin/treonine kinaz 4 (RIPK4) derinin büyümesi ve farklılaşması için önemlidir. Bu çalışmanın amacı RIPK4’ün keratinositlerde yokluğunun HaCaT hücrelerinin farklılaşma süreci üzerindeki etkisini araştırmaktır. Gereç ve Yöntem: Bu deneylerde RIPK4 geni işlevsizleştirilen HaCaT (RIPK4 KO) keratinositleri kullanılmıştır. RIPK4 KO’un farklılaşma statüsünü karşılaştırmak amacıyla, farklılaşmamış bazalbenzeri ve farklılaşmış HaCaT hücreleri, deneylere dâhil edilmiştir. Hücrelerin morfolojileri mikroskopla incelenmiş ve RIPK4 protein seviyeleri Western blot analizi ile belirlenmiştir. Hücrelerin büyüme hızları, hücrelerin 4 gün boyunca sayılması suretiyle takip edilmiştir. Transfeksiyon veriminin analizi için hücreler β-galaktosidaz üreten plazmidlerle transfekte edilmiştir. Farklılaşmaya özgü markörlerin gen ekspresyon seviyeleri real-time PCR ile ölçülmüştür. Bulgular RIPK4 KO hücreleri kümeler halinde büyümeye eğilimli HaCaT hücrelerinden morfolojik olarak farklı bulunmuştur. RIPK4 KO hücrelerinin daha yuvarlak ve birbirinden ayrık büyüyen farklılaşmamış bazal-benzeri hücrelere benzediği gözlemlenmiştir. Hem RIPK4 hem de bazalbenzeri hücrelerde RIPK4 seviyelerinin düşük olduğu tespit edilmiştir. Farklılaşmamış hücre morfolojisine olan benzerliğine paralel olarak RIPK4 KO hücrelerinin HaCaT hücrelerine kıyasla daha hızlı bölündüğü, daha kolay transfekte edildiği ve farklılaşmaya özgü markörlerin ekspresyon seviyelerinin düşük olduğu belirlenmiştir. Sonuç: Sonuçlar, keratinositlerde RIPK4’ün kalıcı olarak yok edilmesinin hücrelerin farklılaşmasını geriye döndürdüğünü göstermiştir.