Comparison of alkaline denaturation method with the referance method HPLC for the estimation of HbF

HbF ölçümünde referans yöntemi olan HPLC ile alkali denatürasyon yöntemini karşılaştırılması

Abstract

PURPOSE: Fetal hemoglobin (HbF; $alpha$2$gamma$2), is the dominant hemoglobin of the fetus from the 8th intrauterine week until birth. The blood of a newborn contains up to 75-90% of fetal hemoglobin. After birth HbF usually drops to the normal adult level of less than 1% by seven months to two years. Higher concentrations of HbF are observed in many acquired and congenital anemias such as hemoglobinopathies. Therefore, an accurate measurement of HbF in the presence of other Hb variants is an essential step in the diagnosis and understanding of various hemoglobinopathies. In clinical laboratories fetal hemoglobin analysis are still mostly done by the alkali denaturation method of Betke. Simple, rapid, accurate, reliable and quantitative HbF measurements are now possible by the recent development of high-pressure liquid chromatographic (HPLC) methods. In this study, we aimed to compare these two methods. METHODS: HbF values of 237 individuals were analyzed HPLC and alkali denaturation methods were compared by use of statistical lineer regression and Altman-Bland analysis. RESULTS: HPLC results correlated well with those obtained by the alkali denaturation. However the linear regression and Altman-Bland analysis showed that the correlation between two methods was obviously different from the line of identity at higher HbF concentrations. CONCLUSION: According to our study we conclude that the sensitivity and reproducability of HPLC method in HbF analysis is superior to those of alkali denaturation . The discordance obsverved in correlations at higher HbF concentrations is probably due to the lack of the alkali denaturation method.

Özet

AMAÇ: Hemoglobin F (HbF, $alpha$_2$gamma$2) , intrauterin yaşamın 8. haftasından doğuma kadar geçen sürede fötusta bulunan temel hemoglobindir.Yenidoğan kanında % 75-90 oranında bulunur. Doğumun ardından azalmaya başlayarak 7-24 aylar arasında erişkin düzeyleri olan %1' in altına düşer. HbF yüksekliği (>%1) çok sayıda doğumsal ve kazanılmış hastalıkta gözlenir.En sık gözlendiği durumlar talasemiler ve anormal hemoglobinler gibi hemoglobinopatilerdir. HbF düzeylerinin doğru ölçümü hemoglobinopatilerin tanı ve yorumunda oldukça önemlidir. Klinik laboratuvarlarda HbF ölçümü yaygın olarak Betke' nin alkali denatürasyon yöntemi ile yapılmaktadır. Son yıllarda, HbF ölçümünde katyon değiştirici poly Cat-A kolonu kullanılarak yapılan yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) yöntemi önerilmektedir.Birçok çalışmada HPLC yönteminin alkali denatürasyon yöntemine göre daha basit, hızlı ve güvenilir olması yanında tekrarlanabilirliğinin yüksek olduğu ileri sürülmektedir. Bu çalışmada bu iki yöntemin karşılaştırılması amaçlanmıştır. YÖNTEM: Bu amaçla 237 bireyin HbF düzeyleri her iki yöntemle ölçülerek, lineer regresyon ve Altman-Bland analizleriyle yöntemler karşılaştırıldı. SONUÇLAR: HPLC ölçümlerinin alkali denatürasyonla iyi kolerasyon gösterdiği belirlendi.Ancak; yüksek HbF düzeylerinde lineer regresyon ve Altman-Bland analizleri ile iki yöntem arasındaki korelasyonun bozulduğu belirlendi. YORUM: Her iki yöntemin karşılaştırılması sonucunda HPLC yönteminin duyarlılık ve tekrarlanabilirliğinin alkali denatürasyon yönteminden daha yüksek olduğu kanısına varıldı. Yüksek HbF düzeylerinde iki yöntem arasında gözlenen korelasyon bozukluğu alkali denatürasyon yönteminin özellikle yüksek HbF düzeylerindeki kısıtlılığına bağlandı.