Studies on tropical theileriosis in Turkey

Fahri SAYIN, Zati VATANSEVER, Zafer KARAER, Şükran DİNÇER, Hasan EREN, Bayram Ali YUKARI, Ayşe ÇAKMAK, Serpil NALBANTOĞLU, Abdullah İNCİ

Abstract

An attempt was made to realise the development of cell culture of Theileria annulata isolates obtained from 7 different sites (Hüseyingazi, Mamak, Sanoba, Eryaman, Akdere, Girmeç, Alacaören) of Ankara county using different methods. The sources of Theileria infected material were peripheral blood collected from 7 living diseased calves each infected experimentally with different Theileria annulata blood stabilates and from 12 living diseased calves infected experimentally with 3 different Theileria annulata tick stabilates. Mononuclear cells infected with Theileria macroschiionts were separated in large numbers from the calf blood as using density gradient method. The infected mononuclear cells were cultivated in complete RPMI-1640 medium (RPMI-J640 supplemented with 20% foetal calf serum, 25 m$mu$ HEPES, 2.0m$mu$ L-glutamine, penicillin 100 IU $ml^{-1}$, streptomycine 100 mg $ml^{-1}$). Cultures were maintained at 37°C. Bovine cell lines developed from the isolates of Mamak, Sanoba, Eryaman, Akdere, Girmeç and Alacaören but it did not develop from the isolate of Huseyingaii. Bovine cell lines did not develop from the peripheral blood of the 3 calves infected with tick stabilates of the Sanoba isolate as well. Passages of the cell lines at different steps were made and cryopreserved in liquid nitrogen. On the other hand, whole peripheral blood collected from 7 living diseased cattle infected with T.annulata in Sanoba, Hasköy, Girmeç, Altındağ, Önder, Kalecik villages were cultivated in the complete RPMI-1640 medium. Cultures were maintained at 37°C. Bovine cell lines developed from all of the isolates. Passages of cell lines at different steps were made and they were cryopreserved in liquid nitrogen.In addition to these, an attempt was made for invitro infection of PBM (peripheral blood mononuclear cell) with theilerial sporozoites. The sporozoites harvested from ticks, each infected with one of T.annulât a Sarioba, T.annulata Akdere, T.annulata Kalecik, and T.annulata Anayurt were introduced invitro to uninfected lymphocytes from different susceptible calves. The two components (lymphocytes and sporozoites) were cultivated in the complete RPMl-1640 medium in wells of open plates maintained in a gassed (5%$C0_2$), humidified incubator. Bovine cell lines developed from the isolates of Sarioba, Kalecik, and Anayurt but it did not develop from the isolate of Akdere. Passages of the cell lines at different steps were made and cryopreserved in liquid nitrogen.

Özet

Bu çalışmada 19 duyarlı deney buzağı kullanılmış, bunlardan 7'sine Ankara'nın değişik yörelerinde (Hüseyingazi, Mamak, Sanoba, Eryaman, Akdere, Girmeç, Alacaören) tropikal theileriosis'e yakalanmış 7 sığırdan alman enfekte kan ayrı ayrı inoküle edilmiş ve bu buzağıların hepsi tropikal theileriosis'e yakalanmıştır. Bu buzağıların herbirinden steril şartlarda alınan enfekte kandan densité gradient yöntemiyle Theileria annulata'nın makroşizontlarıyla enfekte lenfositler izole edilip komple RPMI-1640 vasatına ekilmiştir. Hüseyingazi hariç diğer yerlere ait stabilatlardan T.annıdata'nın süspanse hücre kültürü oluşmuştur. Bütün kültürlerin pasajı yapılmış, bunlar 9'ila 34'üncü basamağa kadar ilerletilip dondurulmuştur. Diğer tarafdan T.annulata Sanoba kene stabilatı ile 4, T.annulata Akdere kene stabilatı ile 6, T.annulata AK-SA kene stabilatı ile 2 duyarlı buzağı inoküle edilmiş ve bu buzağıların hepsi tropikal theileriosis'e yakanlanmışlardır. Bu buzağıların herbirinden alınan enfekte kandan densité gradient yöntemiyle izole edilen T.annulata makroşizontlarıyla enfekte lenfositler komple RPMl-1640 vasatına ekilmişlerdir. Theileria annulata Sanoba kene stabilatı ile enfekte 3 buzağıdan alınan kanlar dışında, diğer bütün buzağılardan alınan kanlardan süspanse hücre kültürü oluşmuştur. Bunların pasajları yapılmış, bu pasajlar 13-39'uncu basamağa kadar ilerletilip dondurulmuştur. Ayrıca beş Sanoba, bir Akdere, bir Kalecik, bir Anayurt T.annulata kene stabilatmın steril buzağılardan izole edilen lenfositlerle ayrı ayrı mıkroplatelerde kültürleri yapılmıştır. Bunlardan T.annulata Sanoba, T.annulata Kalecik ve T.annulata Anayurt kene stabilatlarının hücre kültürleri oluşturulmuştur. Bunların pasajları yapılmış ve bu pasajlar 14-31'inci basamağa kadar ilerletilmiş ve likit nitrojende dondurulmuştur. Bunlara ilaveten Sarıoba-2, Hasköy, Girmeç, Altındağ, Önder-1, Kalecik, Onder-2 T.annulata kan stabilatlarından, densite gradient yöntemiyle şizontla enfekte lenfositler izole edilmeksizin, kan sîabilatları doğrudan komple RPMI-1640 vasatına ekilmiştir. Bunların hepsinden kültür gelişmiş, bu kültürlerin pasajları yapılmış ve bu pasajlar 8-13'üncü basamağa kadar ilerletilmiş ve dondurulmuşlardır.