In vitro capacitation of frozen-thawed bull semen by different capacitating agents

Dondurulmuş boğa spermasının değişik kapasitör maddelerle in vitro kapasitasyonu

Abstract

In this study, the effects of heparin (1st group), caffein plus heparin (2nd group) and caffein plus calcium ionophore (3rd group) on in vitro capacitation of frozen-thawed bull semen were investigated. For this purpose, in the first group, three dosages of heparin (10, 25, 100 |-ig/ml) and three incubation time (5, 15, 60 min.) were examined. In the second group, 5, 10 and 15 inM concentrations of caffein combined with 0, 5, 10, 25 $mu$g/ml heparin and in the third group, 0, 5, 10 mM concentrations of caffein combined with 0.1, 0.2, 0.3 $mu$M calcium ionophore. After induction of capacitation by these agents, a dose of 100 mg/ml lysophosphatidylcholine (LPC) was added to medium to induce acrosome reaction for a period of 15 minutes. To determine the reaction and viability, spermatozoa were stained by dual staining method using trypan blue and Giemsa. Four categories of spermatozoa were identified and counted: 1- Intact acrosome, live; 2- Intact acrosome, dead; 3- Detached acrosome, live; 4- Detached acrosome, dead. In the first, second and third groups the highest results were 25.466% (100 fig/ml heparin, 60 min.), 28.440% (15 mM caffein plus 25 $mu$/ml heparin) and 29.908% (10 mM caffein plus 0,3 $mu$M calcium ionophore), respectively. The mean proportions of capacitated spermatozoa increased as the heparin dosage and incubation period increased in the first group. A synergistic effect of caffein plus heparin and caffein plus calcium ionophore were observed in our study. The total dosages of capacitating agents increased, mean proportions of capacitated spermatozoa increased in the second arid third groups.

Özet

Çalışmada, heparin (1. grup), heparin+kafein (2. grup) ve kafein+kalsiyum ionoforun (3. grup) in vitro spermatozoon kapasitasyonu üzerine etkileri incelendi. Bu amaçla sperma 1. grupta 10, 25 ve 100 $mu$g/ml heparin ile 5, 15 ve 60 dakikalık süreler için ihkübasyona bırakılırken 2. grupta 5, 1O, 15 mM kafein, O, 5, 10, 25 $mu$g/ml heparin ile ve 3. grupta O, 5, 10 mM kafein, 0.1, 0.2, 0.3 $mu$M kalsiyum iyonofor ile kombine edilerek kullanıldı. Kapasitasyonun sağlanmasından sonra spermaya 100 $mu$/ml lizofosfatidilkolin (LPC) ilave edilerek akrozom reaksiyonu (AR) indüklendi. Oluşan reaksiyonun ve spermatozoonlarin canlılıklarının belirlenebilmesi için trypan blue ve Giemsa ile ikili boyama yapıldı. Bu boyama ile spermatozoonların canlılıkları ve reaksiyona girmeleri gruplandırılarak değerlendirildi. Gruplar: l- Canlı, reaksiyon (-); 2- Ölü, reaksiyon (-); 3- Canlı, reaksiyon (+); 4- Ölü, reaksiyon (+) olarak adlandırıldılar. Buna göre, her üç grupta elde edilen en yüksek kapasitasyona uğramış spermatozoon oranları l. grupta (100 Hg/ml heparinle 60 dakika inkübasyon) %25.466, 2. grupta (15 mM kafein+25 $mu$g/ml heparin) %28.440 ve 3. grupta (10 m M kafein+0,3 $mu$M kalsiyum ionofor) %29.908 olarak bulundu, ilk grupta kullanılan heparin konsantrasyonunun ve artan inkübasyon süresinin kapasite olmuş spermatozoon oranlarını arttırdığı gözlendi, ikinci ve üçüncü gruplarda ise kullanılan kapasitör maddelerin birbirlerinin etkilerini destekledikleri ve toplam konsantrasyonlarının artmasına bağlı olarak kapasite olmuş spermatozoon oranlarının yükseldiği belirlendi.