Purification of placental alkaline phosphatase and investigation of it's kinetic properties

Plasental alkali fosfatazın saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

Alkaline phosphatase of human placenta was purified 29.1 fold to a final specific activity of 6.40 U/mg by a procedure involving homogenization with tris buffer pH 8.6, extraction with butanol, ammonium sulphate precipitation, exposure to heat and Sephadex G-200 gel filtration. The apparent Km value of the purified enzyme for p-NPP in 0.1 M glycine-1 mM magnesium buffer, pH 10.5 at 37"C was calculated (estimated) to be 0.50 mM from Lineweaver-Burk plot. The enzyme had a pH optimum 10.6 for p-NPP. Heat inactivation studies showed that the enzyme remained almost 100% stable at 65"C but it was completely inactivated at 78°C. Subsequently, the effects of ferrous sulphate were investigated. The inhibition type for ferrous sulphate was uncompetitive.

Özet

Alkali fosfataz insan plasentasından 29.1 kat saflaştırılarak spesifik aktivitesi 6.40 IU/mg olarak bulunmuştur. Saflaştırma işlemleri, pH 8.6 tris tamponu kullanılarak homojenizasyon, butanol ekstarksiyonu, amonyum sülfatla çöktürme, ısı muamelesi ve Sephadex G-200 jel filtrasyonu basamaklarını içermektedir. Kısmen saflaştırılmış enzimin lineweaver-Burk grafiği çizilerek 37°C'de 0. 1M Glisin-1 mM Mg++ tamponunda (pH 10.5) p-NPPsubstratı için Km değeri 0.5 mM olarak saptandı. Enzimin p-NPP substratı için optimum pH'sı 10.6 olarak bulundu. Yapılan ısı ile inaktivasyon çalışmaları sonucunda, enzimin 65°C'de aktivitesinin hemen hemen %100'ünü koruduğu, 78 °C'de ise aktivitesinin tamamını kaybettiği gözlemlenmiştir. Daha sonra enzim üzerine ferröz sülfatın etkileri denenmiş ve ferröz sülfatın enzimi inhibe ettiği ve inhibisyon tipinin un-kompetitif olduğu saptanmıştır.