Definition of direct bacteria by MALDI-TOF MS system from urinary examples

Abstract

Objective: Rapid identification of bacterial pathogens from urine specimens are essential to establish an adequate antibiotic therapy to treat urinary tract infections and it is very important in terms of cost.Urine culture is gold standard in the diagnosis of UTI (Urinary Track Infection).Urine culture and antibiogram usually takes 48–72 h.The bacteria produced in culture identified within a few minutes while the clinical samples are identified in a short time like two hours by Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).The aim of this study is to contribute identification of the direct bacteria by MALDI-TOF MS system and to start early effective treatment of urine specimens. Methods: We analyzed 152 urine samples with UTI complaints were submitted to the microbiology laboratory between July to November 2015.While some of the samples were experimentally Gram stained, some were not.Formal acid extraction method was applied to urine specimens for direct bacterial identification with MALDI-TOF MS system.In this example, the urine culture was also performed simultaneously. Identification of the colonies in plaque,which was incubated in media at 37 °C in aerobic and 5% CO2 for 18-24 hours of incubation,were performed with the MALDI-TOF MS system. Results: The sensitivity of direct sample from MALDI-TOF MS system was found to be 76%.Statistical analysis was performed to determine whether the Gram stain had any effect on the bacterial load and consequently on the identification of the MALDI-TOF MS system.According to this, there was a significant difference between Gram staining group and non - Gram staining group (p<0.001).Higher identification rates were found in Enterobactericeae, Enterocuccus faecalis, Staphylococcus aureus and Clostridium striatum (except streptococci and nonfermenter Gram negative bacteria), 105 cfu/mL single culture, MALDI-TOF MS directly from urine culture and MALDITOF MS from urine culture. Experimentally, in order to determine the safe identification by MALDI-TOF MS low bacterial concentrations; The E. coli and E. faecalis strains were identified by MALDI-TOF MS with1x106, 5x105, 2.5x105, 1.2x105 ,6x104 and 3x104cfu/mL dilutions. A minimum of 1x106 , 5x105 and2x105 cfu/mL were identified to reliable scores for E. coli strains, while E. faecalis was defined at 1x106 cfu/mL dilution only. Conclusion: In this study, MALDI-TOF MS method the sensitivity 105 and / or 106 cfu/mL higher in the single kind of sample the Gram-mixed or 103 cfu/mL or less from the sample with bacteriuria and yeast identification was not possible. It was thought that Gram stain application determined the bacterial load before identification of direct urine specimen with MALDI-TOF MS system and contributed to the diagnostic performance of MALDI-TOF MS system and Gram stainings should be done for the samples taken for this reason. This method is faster in urine culture with 105 cfu/mL bacterial grow

Özet

Amaç: Üriner sistem enfeksiyonları (ÜSE)’deetken bakterinin erken saptanması; uygun antibiyotiktedavisine kısa sürede başlanması ve maliyet açısındanoldukça önemlidir. ÜSE’nin tanısında idrar kültürü altınstandarttır. Kültür ve antibiyotik duyarlılık testi 48-72 saat sürmektedir. Matriks aracılı lazer dezorpsiyoniyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi (MALDITOF MS) ile kültürde üretilen bakteriler birkaç dakikaiçinde tanımlanırken, direkt klinik örnekten tanımlamagenellikle iki saat gibi kısa bir zaman içinde yapılmaktadır.Bu çalışmanın amacı, idrar örneklerinden MALDI-TOFMS sistemi ile bakterinin direkt olarak tanımlanmasıve tedaviye olabildiğince erken başlanmasına katkısağlamasıdır.Yöntem: Hastanemizin mikrobiyoloji laboratuvarına01 Temmuz - 30 Kasım 2015 tarihleri arasında ÜSEşikayetiyle gönderilen 152 idrar örneği çalışmayaalınmıştır. Rastgele seçilen örneklerin bir kısmınadeneysel olarak Gram boyama yapılırken bir kısmınayapılmamıştır. Direkt idrar örneklerinden MALDI-TOF MSsistemi ile bakteri tanımlanması için örneklere formikasit ekstraksiyon metodu uygulanmıştır. Bu örneklereeş zamanlı olarak idrar kültürü de yapılmıştır. 37 °C’deaerobik ve %5 CO2’li ortamda 18-24 saatlik inkübasyondansonra anlamlı üreme saptanan plaklardaki kolonilerintanımlanması MALDI-TOF MS sistemi ile yapılmıştır.Bulgular: İdrar örneklerinden direkt bakteritanımlanmasında, MALDI-TOF MS sisteminin duyarlılığı%76 olarak bulunmuştur. MALDI-TOF MS sistemi ileekstraksiyon öncesinde bakteriyel yükü belirlemede,Gram boyama yapılmasının test sonuçlarına etkisininbelirlenmesi amacıyla istatistiksel analiz yapılmıştır.Buna göre Gram boyama uygulamasının MALDI-TOF MSsisteminin tanı performansı üzerine etkisi istatistikselolarak anlamlı bulunmuştur (p<0,001). Kültürde 105 tekçeşit bakteri üremesi olan örneklerde, direkt örnektenMALDI-TOF MS ile ve idrar kültüründen MALDI-TOF MS iletanımlanan bakterilere bakıldığında; Enterobactericeae,Enterocuccus faecalis, Staphylococcus aureus veClostridium striatum’da tanımlama oranı yüksekbulunurken, streptokoklar ve nonfermenter Gram negatifbakterilerde tanımlama yapılamamıştır. Deneysel olarakMALDI-TOF MS’in düşük bakteriyel konsantrasyonlardakigüvenli tanımlama düzeyini belirlemek amacıyla; E. colive E. faecalis suşlarının 1x106, 5x105, 2x105, 1,2x105,6x104 ve 3x104 kob/mL dilüsyonları yapılarak MALDITOF MS ile tanımlanmıştır. E. coli suşu, 1x106, 5x105 ve2,5x105 kob/mL dilüsyonlarında, E. faecalis ise sadece1x106 kob/mL dilüsyonda yüksek düzey güven aralığındabulunmuştur.Sonuç: Bu çalışmada, MALDI-TOF MS yöntemininduyarlılığı 105 ve/veya 106 kob/mL tek çeşit Gram negatifbakteriüri olan örneklerde yüksek (%76) bulunurken,karışık veya 103 kob/mL ve altında bakteriüri veyacandidüri olan örneklerde tanımlama yapılamamıştır.Ek olarak MALDI-TOF MS yöntemiyle idrar örneğindendirekt bakteri tanımlanması öncesinde Gram boyamauygulamasının etkinliği araştırılmış ve Gram boyamanınMALDI-TOF MS sisteminin tanı performansına katkısağladığı ve bu nedenle çalışmaya alınan örneklere Gramboyama yapılması gerektiği düşünülmüştür. Bu yöntem,idrar kültüründe 105 kob/mL tek bakteri üremesi olanhastalarda, klasik kültür yöntemine göre daha hızlı sonuçverebilmektedir.