Yüksek Performanslı İnce Tabaka Kromatografi Yöntemi ile Moringa Oleifera Yaprak Ekstrelerindeki Fitokimyasalların Deney Tasarımı Yaklaşımı ile Tayini

A High Performance Thin Layer Chromatographic Method Using a Design of Experiment Approach for Estimation of Phytochemicals in Extracts of Moringa Oleifera Leaves

Asha THOMAS,Abhilash KANAKDHAR,Adinath SHIRSAT,Sanjeevani DESHKAR,Lata KOTHAPALLI

Abstract

Amaç: Moringa oleifera yapraklarının etanol ve su ile hazırlanan ekstrelerinde gallik asit (GA), kersetin (QT) ve rutin (RT) miktarlarının eşzamanlı olarak tayin edilebilmesi amacıyla sistematik deney tasarımına (DoE) dayalı hassas ve güçlü yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) yöntemi geliştirilmiştir. Gereç ve Yöntemler: Kromatografik ayırım Merck TLC Silika Jel Plakada 60 F254 (10×10 cm) hareketli faz olarak tolüen: etil asetat: metanol: formik asit (4,9:4,1:2:0,5; h/h/h/h) kullanılarak ve 300 nm’de yoğunluk taraması yapılarak gerçekleştirilmiştir. Kritik yöntem parametreleri ilk olarak iki faktöryelli deney tasarımı ile belirlenmiş daha sonra bu parametreler seçilen kritik analitik özellikler, alıkonma faktörü ve pik alanı üzerindeki etkileri değerlendirilerek merkez kompozit tasarım kullanılarak sistematik olarak optimize edilmiştir. Bulgular: Üretilen modeller için oluşturulan Pareto çizelgeleri, 3B yanıt yüzey grafikleri ve polinom denklemleri, seçilen faktörlerin QT, GA ve RT yanıtları üzerine anlamlı etkileri olduğunu göstermiştir. Uygulanan istenebilirlik ve bindirme grafikleri ile deneysel olarak doğrulanmış uygun çözümler sağlanmıştır. Optimize edilen koşullarda, biyobelirteçler; GA, QT ve RT, sırasıyla 0,64±0,02, 0,80±0,03 ve 0,22±0,02 alıkonma zamanları, geniş doğrusal dinamik aralık (herbiri 200-1200 ng/bant), yüksek doğruluk (%98,1-99, 4) ve gün içi ve günler arası kesinlik (%RSD <%2) ile uygun şekilde ayrılmıştır. Bu biyobelirteçlerin Moringa oleifera ekstrelerindeki miktar tayininde etanol ve su ile hazırlanan ekstrelerde daha yüksek QT içeriği saptanmıştır (sırasıyla 993,5 µg/g ve 832 µg/g). Etanol ile hazırlanan ekstrede daha fazla RT (701 µg/g) olduğu görülmüştür. Bunun tersine, su ile hazırlanan ekstrede gözlenen GA (591,1 µg/g) oranının, etanol ile hazırlanan ekstreye (150 µg/g) göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Sonuç: DoE yaklaşımı ile geliştirilen bu geçerli HPTLC yöntemi, Moringa oleifera ekstrelerinden GA, QT ve RT miktar tayinleri için başarıyla kullanılmıştır ve bu yaklaşımın diğer bitkisel ekstrelerde de bu biyobelirteçlerin miktarlarının eşzamanlı olarak tayin edilebilmesini sağlayarak analiz süresini kısaltacağı ve maliyet tasarrufu sağlayacağı düşünülmüştür.

Özet

Objectives: A systematic design of experiment (DoE) based sensitive, robust high performance thin layer chromatographic (HPTLC) method wasestablished for simultaneous estimation of gallic acid (GA), quercetin (QT), and rutin (RT) from ethanolic and aqueous leaf extracts of Moringaoleifera.Materials and Methods: The chromatographic separation was carried on Merck TLC aluminum sheets of silica gel 60 F254 (10×10 cm) with mobilephase of toluene: ethyl acetate: methanol: formic acid (4.9:4.1:2:0.5, v/v/v/v) with densitometric scanning at 300 nm. The critical method parameterswere initially identified by regular two level factorial design and further systematically optimized using a central composite design, evaluating theeffect on selected critical analytical attributes, retention factor (RF), and peak area.Results: The Pareto charts, 3D response surface plots, and polynomial equations for the generated models suggested significant influence of theselected factors on responses of QT, GA, and RT. The desirability and overlay plots employed provided appropriate solutions that were experimentallyvalidated. Under the optimized conditions, the biomarkers were suitably resolved with RF values of 0.64±0.02, 0.80±0.03, and 0.22±0.02 for GA,QT, and RT, respectively, with wide linear dynamic range (200-1200 ng/band each), high accuracy (98.1-99.4%), and intra- and interday precision(%RSD <2%). When employed for quantification of these biomarkers in Moringa oleifera extracts, the ethanolic and aqueous extracts exhibited highercontent of QT (993.5 µg/g and 832 µg/g, respectively). The ethanolic extract showed a larger amount of RT (701 µg/g). In contrast, aqueous extractexhibited a higher proportion of GA (591.1 µg/g) compared to ethanolic extract (150 µg/g).Conclusion: This validated HPTLC method developed through a DoE approach was successfully employed for quantification of GA, QT, and RT fromMoringa oleifera extracts and may also be extended for their simultaneous estimation in other herbal extracts, thereby reducing time, and may serveas a cost effective tool for analysis.