Effect of N-acetylcystein on Antibiofilm Efficiency of Antibiotics in Staphylococci Isolates

Stafilokok İzolatlarında Antibiyotiklerin Antibiyofilm Etkinliği Üzerine N-asetilsisteinin Etkisi

Abstract

Biofilms are often responsible for the difficulties in the treatment of infectious diseases due to their properties that facilitate escape from antibiotic effect and their antiphagocytic effects. At least 65% of all infectious diseases are associated with biofilm-forming bacteria. As Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis are among the most common agents of hospital infections and the infections are mostly biofilm-related, they pose an important problem. In infectious isolates, the minimum biofilm eradication concentration (MBEK) values of biofilm forms are much higher than the minimum inhibition concentration (MIC) values of planktonic forms. This situation requires the use of much higher doses of antibiotics in the treatment of infections and causes an increase in antibiotic resistance. The N-acetylcysteine (NAC) molecule is known to be effective against biofilm by disrupting mature biofilms and reducing the adhesion of bacteria to surfaces. In this study, it was aimed to demonstrate i) the biofilm-forming abilities ii) the change in ampicillin and vancomycin MIC values in the presence of NAC molecules, iii) the change in the MBEK values of these antibiotics in the presence of NAC molecule and iv) the change in the expression levels of genes thought to be related to biofilm formation in the presence of the NAC molecule among S.aureus (n= 38) and S.epidermidis (n= 12) isolates isolated from various clinical specimens in Trakya University Health Research and Application Center. In this study, microplate crystal violet method was used to demonstrate the biofilm formation in staphylococci. Broth microdilution and checkerboard method were used to demonstrate the change in the presence of NAC molecule of the MIC and MBEC values of ampicillin and vancomycin. The effect of NAC on the expression of intercellular binding proteins A and D (icaA, icaD) and Staphylococcus regulatory protein A (sarA) genes, which are the genes involved in biofilm formation in staphylococci, was determined by quantitative real-time Polymerase Chain Reaction (qRt-PCR) method. The Student-t test was used to compare the control and experimental groups (concentrations detected with synergy and additive effect); p˂ 0.05 was accepted as the limit value of significance. In this study, when the NAC molecule was used together with ampicillin and vancomycin, it was determined that this combination lowers the MIC values of staphylococcus isolates and staphylococcal biofilm MBEK values; and also the expression levels of icaA, icaD and sarA which were effective in biofilm formation in staphylococci have not changed and decreased. As a result, in this study, it has been determined that the NAC molecule can be a new alternative for combined drug therapy and is promising in terms of bringing a new approach to treatment. In addition, it is thought that it is possible to use the NAC molecule together with different microorganisms and antimicrobial agents, and the results obtained in this study are considered to be guiding for further studies on this subject.

Özet

Biyofilmler, antibiyotik etkisinden kaçmayı kolaylaştıran özellikleri ve antifagositik etkileri nedeniyle enfeksiyon hastalıklarının tedavisini güçleştirmiştir. Tüm enfeksiyon hastalıklarının en az %65’i biyofilm oluşturan bakteriler ile ilişkilidir. Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermidis, hastane enfeksiyonlarının en sık etkenlerinden olmaları ve enfeksiyonların çoğunlukla biyofilm kaynaklı olması nedeniyle önemli bir sorun oluşturmaktadır. Enfeksiyon etkeni izolatlarda, biyofilm formlarının minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyon (MBEK) değerleri, planktonik formların minimum inhibisyon konsantrasyon (MİK) değerlerine göre çok daha yüksektir. Bu durum, enfeksiyonların tedavisinde çok daha yüksek dozlarda antibiyotik kullanımını gerektirmekte ve antibiyotik direncinin artışına neden olmaktadır. N-asetilsistein (NAC) molekülünün, olgun biyofilmleri bozarak ve bakterinin yüzeylere adezyonunu azaltarak biyofilme karşı etkili olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, Trakya Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezinde çeşitli klinik örneklerden izole edilen S.aureus (n= 38) ve S.epidermidis (n= 12) izolatının, i) biyofilm oluşturma yeteneklerinin, ii) ampisilin ve vankomisinin MİK değerlerinin NAC molekülü varlığındaki değişiminin, iii) bu antibiyotiklerin MBEK değerlerinin NAC molekülü varlığındaki değişimin, ve iv) biyofilm oluşumu ile ilgili olduğu düşünülen genlerin ekspresyon düzeylerinin NAC molekülü varlığındaki değişiminin ortaya konması amaçlanmıştır. Çalışmada, stafilokoklarda biyofilm oluşumunun gösterilmesi için mikroplak kristal viyole yöntemi kullanılmıştır. Ampisilin ve vankomisinin, MİK ve MBEK değerlerinin NAC molekülü varlığındaki değişiminin ortaya konması için sıvı mikrodilüsyon ve dama tahtası yöntemi kullanılmıştır. Stafilokoklardaki biyofilm genleri olan hücreler arası bağlanma proteini A ve D (icaA, icaD) ve Staphylococcus yardımcı düzenleyici protein A (sarA) genlerinin ekspresyonu üzerine NAC’ın etkisi kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRt-PCR) yöntemi ile incelenmiştir. Sinerji ve aditif etki tespit edilen konsantrasyonların karşılaştırılmasında Student-t testi kullanılmış ve p˂ 0.05 değeri anlamlılık sınır değeri olarak kabul edilmiştir. Bu çalışmada NAC molekülünün, ampisilin ve vankomisin ile birlikte kullanıldığında, bu kombinasyonun stafilokok izolatlarının MİK değerlerini ve stafilokok biyofilm MBEK değerlerini düşürdüğü ve ayrıca stafilokoklarda biyofilm oluşumunda etkili olan icaA, icaD ve sarA genlerinde, fark saptanmayan ve azalış gösteren ekspresyon düzeyleri tespit edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada, NAC molekülünün kombine ilaç tedavisi için yeni bir alternatif olabileceği ve tedaviye yeni bir yaklaşım kazandırması açısından umut vadedici olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, NAC molekülünün farklı mikroorganizmalar ve antimikrobiyal ajanlar ile birlikte kullanılmasının da mümkün olabileceği ve bu konuda yapılacak olan ileri çalışmalar açısından bu çalışmada elde edilen bulguların yol gösterici olduğu düşünülmüştür.