Evaluation of Real-Time Polymerase Chain Reaction in Pneumocystis jirovecii Laboratory Diagnosis

Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi

Soykan ÖZKOÇ,Ceren ERGÜDEN GÜRBÜZ,Ayça Arzu SAYINER,Songül Bayram DELİBAŞ

Abstract

Pneumocystis jirovecii is a human-specific species and causes fatal infections like P.jirovecii pneumonia (PCP) in immunocompromised persons. Although direct microscopy is the gold standard in the diagnosis of the microorganism, molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR) are needed in non-human immune deficiency virus (HIV) immunosuppresive patients with low P.jirovecii burden. In this study, we aimed to evaluate the value of real-time PCR (Rt-PCR) in the laboratory diagnosis of P.jirovecii. Bronchoalveolar lavage (BAL) specimens of 658 patients sent to Dokuz Eylul University Hospital Central Medical Parasitology Laboratory on suspicion of PCP were included in the study. BAL fluids were evaluated for identification of P.jirovecii mitochondrial gene coding ribosomal large subunit (mtLSUrRNA) using Rt-PCR. In addition, Giemsa and Gomori’s methenamine silver (GMG) staining assays were applied to all samples and nested PCR (n-PCR) assay was applied to positive samples detected by real time PCR. Ninety-two (14.3%) of these samples were positive by Rt-PCR. Of these 92 patients, 85 (92.4%) were positive with n-PCR. Only seven of the specimens had P.jirovecii cysts and trophozoites with microscopic examination. The mean cycle threshold (CT ) value of Rt-PCR positive patients was 29.7 (18.17 ≤ CT ≤ 37.96). P.jirovecii load in these patients was calculated as 2.6 x 101-6.15 x 107 copies/ml. The difference between the mean CT values of n-PCR positive and negative results was statistically significant (p< 0.01). The CT values of Rt-PCR of the samples with positive microscopy were; 18.2, 20.9, 22.2, 24.3, 24.7, 26.5, 29.7. The difference between the CT means of the samples with positive and negative microscopy was statistically significant (p< 0.05). When positive patients were grouped according to their diagnosis; the lowest mean CT value (CTmean= 24.8) was found in HIV-positive patients. On the other hand, CT values were found to be significantly lower in the organ transplantation patients (CTmean= 26.15) and in the collagen-vascular-inflammatory patient group (CTmean= 27.8). This study demonstrated that Rt-PCR was the effective method in the diagnosis of P.jirovecii in the laboratory. Conventional n-PCR method was found to be more unsuccessful than Rt-PCR in the presence of very low density organism; direct microscopy is generally found to be positive in samples with a higher burden of P.jirovecii

Özet

İnsana özgül bir tür olan Pneumocystis jirovecii, immün sistemi baskılanmış kişilerde P.jirovecii pnömonisi (PCP)’ne neden olarak ölümcül enfeksiyonlara yol açmaktadır. Mikroorganizmanın tanısında direktmikroskopi altın standart olsa da düşük P.jirovecii yükünün gözlendiği insan immün yetmezlik virüsü (HIV)dışı immünsupresif hastalarda polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler yöntemlere gereksinimduyulmaktadır. Bu çalışmada gerçek zamanlı PCR (Rt-PCR) yönteminin P.jirovecii laboratuvar tanısındakideğerinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Tıbbi Parazitoloji Laboratuvarına PCP şüphesiyle gönderilen 658 hastanın bronkoalveoler lavaj (BAL) örneği çalışmayadahil edilmiştir. BAL sıvısı örnekleri P.jirovecii ribozomal RNA büyük alt ünitesini kodlayan mitokondriyalgeni (mtLSUrRNA) çoğaltan Rt-PCR yöntemi ile değerlendirilmiştir. Tüm örneklere Giemsa ve Gomori’ninmetenamin gümüş (GMG) boyaları uygulanırken Rt-PCR ile pozitif saptanan örnekler ayrıca nested-PCR(n-PCR) yöntemi ile de değerlendirilmiştir. Bu örneklerin 92 (%14.3)’si Rt-PCR ile pozitif olarak bulunmuştur. n-PCR ile 92 hastanın 85 (%92.4)’inde pozitiflik saptanmıştır. Mikroskobik inceleme sonucundaise örneklerin yalnızca yedisinde P.jirovecii kist ve trofozoitlerine rastlanmıştır. Rt-PCR pozitif hastalarınortalama “cycle threshold (CT)” değeri 29.7 (18.17 ≤ CT ≤ 37.96) olarak saptanmıştır. Bu hastalardakiP.jirovecii yükü 2.6 x 101-6.15 x 107 kopya/ml olarak hesaplanmıştır. n-PCR ile pozitif saptanan örneklerinRt-PCR’deki CT değerlerinin ortalaması (CTort= 29.2) ile negatif bulunanların ortalaması (CTort= 36.7)arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0.01). Mikroskopisi pozitif olan örneklerin RtPCR’deki CT değerlerinın sırasıyla; 18.2, 20.9, 22.2, 24.3, 24.7, 26.5, 29.7 olduğu görülmüştür. Mikroskopisi pozitif ve negatif olan örneklerin CT ortalamaları arasındaki fark yine istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0.05). Pozitif bulunan hastalar tanılarına göre gruplandığında; en düşük CT değer ortalamasının (CTort=24.8) HIV pozitif hastalarda olduğu görülmüştür. Organ transplantasyonu hastaları (CTort= 26.15) vekolajen-vasküler-enflamatuvar hasta grubunda (CTort= 27.8) saptanan CT değer ortalamaları diğer gruplardan istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük bulunmuştur. Bu çalışma, Rt-PCR’nin P.jirovecii laboratuvar tanısında etkili bir yöntem olduğunu ortaya koymuştur. Konvansiyonel n-PCR yönteminin çok düşükyoğunluktaki etken varlığında Rt-PCR’ye göre daha başarısız olduğu; direkt mikroskopinin ise genellikleetkenin yoğun olduğu örneklerde pozitif sonuç verdiği anlaşılmaktadır.