Investigation of Plasmid Mediated mcr Colistin Resistance Gene in Clinical Enterobacterales Isolates

Klinik Enterobacterales İzolatlarında Plazmit Aracılı mcr Kolistin Direnç Geninin Araştırılması

Esra ÖZKAYA,Celal Kurtuluş BURUK,Bayram TORAMAN,İlknur TOSUN,Neşe KAKLIKKAYA,Faruk AYDIN

Abstract

Carbapenems are used in the treatment of infections caused by multidrug-resistant bacteria and colistin (polymyxin E) is used as the last choice of antimicrobial agent in those resistant to carbapenems. The worldwide and increased use of colistin, which causes cell death by disrupting the permeability of the cytoplasmic membrane of gram-negative bacteria, raised the problem of resistance. The transferable colistin resistance enzyme mcr, is a phosphoethanolamine transferase that adds phosphoethanolamine to lipid A and modifies lipopolysaccharides, leading to polymyxin resistance. The aim of this study was to investigate some of the most prevalent plasmid mediated colistin and carbapenemase resistance genes in colistin resistant Enterobacterales isolates. Enterobacterales isolates which were isolated in the samples of patients treated in the clinical units between October 2016 and September 2018 in the Karadeniz Technical University Faculty of Medicine Farabi Hospital Medical Microbiology Laboratory were included in the study. In addition to conventional methods, isolates were identified to the species level by MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Germany). The antibiotic susceptibilities of Enterobacterales isolates were studied by an automated microbiology system (Phoenix, Becton Dickinson, USA) and evaluated according to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) criteria. In isolates that are resistant to colistin, and the isolates that are found to be sensitive but should be included in the patient report of the colistin susceptibility test, colistin susceptibility tests were repeated with liquid microdilution method in accordance with EUCAST standards. The presence of extended spectrum beta-lactamase (ESBL), AmpC beta-lactamase and carbapenemase were determined by phenotypic methods according to EUCAST recommendations in colistin resistant Enterobacterales isolates. Furthermore, resistance genes of mcr-1-5, blaOXA-48, blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaIMP were detected by polymerase chain reaction (PCR) method, followed by nucleotide sequence analysis of the amplified products. In our study, 14657 Enterobacterales isolates belonging to 7535 patients treated in different clinical units were examined retrospectively. Escherichia coli 61.2% (n= 8968), Klebsiella pneumoniae 22.7% (n= 3334) and Enterobacter cloacae 6.9% (n= 1005) were the most prevalent isolates. Carbapenem resistance was detected in 894 isolates, and 5.8% (n= 412) of 7135 isolates isolated between October 2016 and September 2017; 6.4% (n= 482) of 7522 isolates between October 2017 and September 2018 were found to be resistant. Considering all isolates, colistin resistant isolates were 65 (0.9%) between October 2016 and September 2017 and 97 (1.3%) between October 2017 and September 2018. By including only the first isolates in the study for the same agent growths in different samples of the same patient, 46 colistin resistant isolates were selected. Six isolates which could not be cultivated from stock cultures were excluded from the study material. Thirteen (32.5%) of the 40 colistin resistant Enterobacterales isolates were isolated in 2017 and 27 (67.5%) were isolated in 2018. ESBL was

Özet

Çoklu ilaca dirençli bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlarda karbapenemler, karbapeneme dirençliolanlarda ise kolistin (polimiksin E) son çare olarak kullanılmaktadır. Gram-negatif bakterilerin sitoplazmikmembranının geçirgenliğini bozarak hücre ölümüne neden olan kolistinin tüm dünyada kullanımının artışıdirenç sorununu gündeme getirmiştir. Aktarılabilir kolistin direnci enzimi olan mcr, lipid A’ya fosfoetanolamin eklenip lipopolisakkaritleri modifiye ederek polimiksin direncine yol açan bir fosfoetanolamin transferazdır. Bu çalışmada kolistine dirençli Enterobacterales izolatlarında en yaygın görülen plazmit aracılı bazıkolistin ve karbapenemaz direnç genlerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi Farabi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarında Ekim 2016-Eylül 2018 tarihleriarasında klinik birimlerde tedavi gören hastaların numunelerinde tespit edilen Enterobacterales izolatları kullanılmıştır. İzolatlar klasik yöntemlere ilaveten MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonics, Almanya) ile tür düzeyindetanımlanmıştır. Enterobacterales izolatlarının antibiyotik duyarlılıkları Phoenix (Becton Dickinson, ABD) otomatize mikrobiyoloji sistemi ile çalışılmıştır ve “European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing(EUCAST)” önerilerine göre değerlendirilmiştir. Kolistine dirençli bulunan izolatlarda ve duyarlı saptananancak kolistin duyarlılık test sonucu hasta raporuna eklenmesi gereken izolatlarda kolistin duyarlılık testleriEUCAST standartlarına uygun olarak sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle tekrarlanmıştır. Kolistine dirençli Enterobacterales izolatlarında EUCAST önerileri doğrultusunda genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL),AmpC beta-laktamaz ve karbapenemaz varlığı fenotipik yöntemlerle araştırılmıştır. Ayrıca, polimeraz zincirreaksiyonu (PCR) yöntemiyle mcr-1-5, blaOXA-48, blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaIMP direnç genleri araştırılmış,ardından amplifiye edilen ürünlerin nükleotit dizi analizleri yapılmıştır. Çalışmamızda, farklı klinik birimlerdetedavi gören 7535 hastaya ait 14657 Enterobacterales izolatı retrospektif olarak irdelendiğinde en sık Escherichia coli %61.2 (n= 8968), Klebsiella pneumoniae %22.7 (n= 3334) ve Enterobacter cloacae %6.9 (n= 1005)olduğu görülmüştür. Karbapenem direnci toplamda 894 izolatta tespit edilmiş olup; Ekim 2016-Eylül 2017 tarihleri arasında izole edilen 7135 izolatın %5.8 (n= 412)’i, Ekim 2017-Eylül 2018 tarihleri arasında izoleedilen 7522 izolatın %6.4 (n= 482)’ü dirençli bulunmuştur. Tüm izolatlar içinde kolistine dirençli bulunanizolatlar Ekim 2016-Eylül 2017 tarihleri arasında 65 (%0.9) iken, Ekim 2017-Eylül 2018 tarihleri arasında 97(%1.3)’dir. Aynı hastaya ait farklı örneklerdeki aynı etken üremelerinde sadece ilk izolatlar çalışmaya dahiledilerek kolistine dirençli 46 izolat seçilmiştir. Stok kültürden üretilemeyen 6 izolat çalışma materyalindençıkarılmıştır. Çalışmaya dahil edilen kolistine dirençli 40 Enterobacterales izolatının 13 (%32.5)’ü 2017, 27(%67.5)’si 2018 yılında izole edilmiştir. Bu izolatların 22’sinde GSBL, 6’sında AmpC beta-laktamaz, 15’indekarbapenem direnci fenotipik yöntemlerle tespit edilmiştir. Bu işlemlerin ardından PCR yöntemiyle 2 izolattamcr-1, 2 izolatta blaOXA-48, 1 izolatta blaVIM, 1 izolatta blaKPC ve blaOXA-48 birlikteliği, 5 izolatta blaNDM ve blaOXA-48 birlikteliği tespit edilmiştir. mcr-1 saptanan izolatlarda nükleotit dizi analizi ile doğrulama yapılmıştır.Tespit edilen mcr-1 genleri hastanemizde tedavi gören 65 yaş üstü 2 kadın hastanın idrar kültürü örneklerinde üreyen E.coli izolatlarında bulunmuştur. Bu hastalardan 1’inde test edilen antibiyotikler arasında sadeceampisiline direnç gözlenmiş, diğerinde ise ampisilin, amoksisilin-klavulonik asit ve siprofloksasine dirençbelirlenmiştir. Sonuç olarak, yayınımız literatürde ulaşabildiğimiz kadarıyla ülkemizde klinik örneklerde mcr1 geni varlığını gösteren ve DNA dizi analizi ile doğrulanmış ilk çalışmadır. Çoklu ilaç direnci görülmeyenizolatlarda mcr geninin saptanmış olması tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarında kolistin duyarlılık testi çalışılmasının önemini bir kez daha gözler önüne sermektedir. Ayrıca çalışmamızda farklı direnç genlerini birarada içeren izolatların saptanmış olması, karbapenem ve kolistin direncinin yayılımının beklenenden dahahızlı olabileceğini bir kez daha hatırlatmıştır.