İlaç dirençli MCF-7 hücrelerinde ß-tübülin izotiplerinin değişen ifadelenme düzeyleri ve TUBB gen mutasyonları

Drug Resistant MCF-7 cells have altered expression levels of ß-tubulin isotypes and mutations in TUBB gene

Abstract

Antimicrotubule agents paclitaxel, docetaxel and vincristine are used in treatment of breast cancer. They bind to ß-tubulin subunit of microtubules. Multidrug resistance developed against these drugs remains a serious clinical problem. Different ßtubulin izotypes possess differential assembly/disassembly dynamics. In this study, expressions of ß-tubulin isotypes, and mutations in TUBB gene were investigated in paclitaxel, docetaxel and vincristine resistant MCF-7 breast carcinoma cell lines. Resistant sublines were developed in the laboratory by continuous drug applications in dose increments and development of resistance were assayed by cytotoxicity analysis. Gene expression levels of ß-tubulin isotypes were investigated by RT-PCR. Exon 4 of the TUBB gene was amplified by PCR and the products were sequenced for determination of mutations. According to expression analysis, mRNA levels of ßII-, ßIII- and ßV-tubulin isotypes were significantly upregulated in paclitaxel and docetaxel resistant cells where they were significantly downregulated in vincristine resistant cells. Sequence analysis of exon 4 of TUBB gene coding for ßI-tubulin revealed that MCF-7/120nMDoc cells carry Gln-327 → His mutation and MCF-7/120nMVinc cells have His-179 → Pro mutation. In conclusion, differential expression levels of ßII-, ßIII- and ßVtubulin isotypes and mutations in TUBB gene were determined in paclitaxel, docetaxel and vincristine resistant MCF-7 cells. It was shown for the first time that ßV-tubulin expression level may be correlated to resistance to antimicrotubule drugs. Though more functional analysis is required, the data presented here provides an insight into mechanisms of paclitaxel, docetaxel and vincristine resistance through alterations in tubulin/microtubule system.

Özet

Meme kanserinin tedavisinde kullanılan antimikrotübül ajanlar paklitaksel, dosetaksel ve vinkristin, mikrotübüllerin ß–tübülin alt grubuna bağlanmaktadırlar. Bu ilaçlara karşı gelişen çoklu ilaç dirençliliği tedavinin başarısını kısıtlayan önemli bir problemdir. Bu çalışmada, paklitaksel, dosetaksel ve vinkristine dirençli MCF-7 meme karsinomu hücre hatlarında ß–tübülin izotiplerinin gen ifade düzeyleri ve TUBB gen mutasyonları incelenmiştir. Dirençli hücre hatları artan dozlarda seçici ilaç uygulamaları ile geliştirilmiş ve dirençlilik gelişimi sitotoksisite testleri ile belirlenmiştir. Gen ifade düzeyleri geri transkriptaz-polimeraz zincirleme reaksiyonu (GT-PZR) ile incelenmiştir. TUBB geninin dördüncü egzonu PZR yöntemi ile çoğaltılmış ve DNA dizi analizi yapılmıştır. Gen ifade düzeyleri incelendiğinde, paklitaksel ve dosetaksele dirençli hatlarda ßII-, ßIII- and ßV-tübülin izotiplerinin ifade düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı artış olduğu, vinkristine dirençli hatta ise bu genlerin ifade düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı azalma olduğu saptanmıştır. DNA dizi analizi sonuçlarına göre, dosetaksele dirençli hücrelerde Gln-327 → His, vinkristine dirençli hücrelerde ise His-179 → Pro mutasyonu bulunduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada, paklitaksel, dosetaksel ve vinkristine dirençli MCF-7 hücrelerinde farklı mikrotübül dinamiğine sahip ßII-, ßIII- and ßV-tübülin izotip ifade düzeylerinde anlamlı değişiklikler olduğu görülmüştür. Aynı zamanda dosetaksel ve vinkristine dirençli hücrelerde ßI–tübülinini kodlayan TUBB geninde ilaç bağlanması ile ilgili bölgelerde iki farklı mutasyon belirlenmiştir. Dirençli hücrelerde ßV-tübülinin ifade düzeyindeki değişiklik ise ilk defa gösterilmiştir. Bu çalışmadan elde edilen bulgular paklitaksel, dosetaksel ve vinkristine karşı gelişen dirençlilik mekanizmalarında tübülin/mikrotübül dengesindeki değişimlerin önemli olabileceği ile ilgili aydınlatıcı bilgiler içermektedir.