Journals / Mikrobiyoloji Bülteni / 2009 / Cilt: 43 - Sayı: 4
Influence of reaction optimization on the results of PCR amplification of Panton-Valentine leukocidin genes among Staphylococcus aureus isolates
- Journal
- Mikrobiyoloji Bülteni
- Pages
- 519–528
- DOI
- —
Abstract
Panton-Valentine leukocidin (PVL) is an important virulence determinant of Staphylococcus aureus. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the genes encoding PVL is the most widely used method for determining PVL-positivity. In this study, we used two different primer sets and different annealing temperatures for each set to investigate the effect of optimization of PCR parameters on the amplification results. A total of 321 S.aureus clinical isolates (84.4% methicillin-resistant S.aureus, 76.9% no-socomial) were included to the study. Two different primer sets and two different annealing temperatures were applied for the amplification of PVL gene. For this purpose while luk-PV-1 and luk-PV-2 primers and 55°C and 58°C annealing temperatures were used to amplify the 433 bp region inhabiting the luk-S PVand luk-F PV genes, PVLup and PVLdn primers and 50°C and 48°C annealing temperatures were used to amplify the 1918 bp region inhabiting the same genes. luk-PV-1 and luk-PV-2 primers yielded ampiicons at 55°C in 50.2% (161/321) and at 58°C in 1.6% (5/321) of the isolates. To discriminate the positive ampiicons from the crossly amplified PCR products, restriction endonuclease analysis was performed and it was observed that the five ampiicons generated by luk-PV-1 and luk-PV-2 primers at 58°C were cut by BspH1 enzyme as expected for the positive ampiicons. None of the isolates yielded ampiicons by PVLup and PVLdn primers at 50cC, however, only 1.6% of the isolates yielded ampiicons at 48°C. These isolates were the same with the ones that were PVL positive with luk-PV-1 and luk-PV-2 primers at 58°C. These data revealed that only 1.6% of the study isolates were PVL positive. These results showed that inappropriate cycling conditions may lead to false-negative or false-positive results in PVL-gene amplification. Restriction endonuclease or sequence analysis may be used to differentiate crossly-amplified sequences from PVL-positive ampiicons. We suggest using different primers and different annealing temperatures in PVL gene amplification before concluding on the study results. Using positive and negative control strains in each run and optimization of the study protocol not only according to the literature data but also due view to the laboratory experience seems critical for obtaining reliable data.
Özet
Panton-Valentin lökosidini (PVL), Staphylococcus aureus'un önemli bir virülans faktörüdür. PVL pozitifliğini saptamada, PVL'yi kodlayan gen bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifikasyonu en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu çalışmada, iki farklı primer seti ve her set için farklı bağlanma sıcaklıkları kullanılarak, primer seçiminin ve termal döngü koşullarının PCR ile PVL gen amplifikasyon sonuçları üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, çeşitli klinik örneklerden izole edilen toplam 321 adet S.aureus susu (%84.4'ü metisiline dirençli; %76.9'u hastane kökenli) dahil edilmiştir. Suşların PVL gen amplifikasyonları için iki farklı primer seti ile ikişer farklı bağlanma sıcaklığı uygulanmıştır. Bu amaçla, luk-S PVve luk-FPVgenlerini içeren 433 bç'lik bölgeyi çoğaltmak için luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ve amplifikasyon için 55°C ve 58°C'lik sıcaklıklar kullanılırken; aynı genleri kapsayan 1918 bç'lik bölgeyi çoğaltmak için PVLup ve PVLdn primerleri ve amplifikasyon için 50°C ve 48°C'lik bağlanma sıcaklıkları uygulanmıştır. Çalışmamızda, luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile S.aureus izolatlarının %50.2 (161/321 )'sin-de 55°C'de amplikon elde edilirken, 58°C'de sadece %1.6 (5/321 )'sında amplikon elde edilmiştir. PVL pozitif amplikonların, hatalı amplifiye edilen PCR ürünlerinden ayrımını yapabilmek amacıyla, restriksiyon endonükleaz analizi yapılmış ve luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile 58cC'de elde edilen beş amplikonun da, BspH1 enzimi ile PVL pozitif amplikonlarda beklenildiği şekilde kesildiği görülmüştür. PVLup ve PVLdn primerleri ile yapılan deneylerde ise 321 S.aureus izolatının hiçbiri (pozitif kontrol susu hariç) 50°C'de amplikon vermemiş, sıcaklık 48°C'ye indirildiğinde beş (%1.6) klinik izolatta PVL pozitifliği saptanmıştır. Bu izolatların da luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile 58°C'de PVL pozitif bulunan suşlar ile aynı olduğu izlenmiştir. Bu veriler, çalıştığımız izolatlardaki gerçek PVL gen pozitifliğinin %1.6 (5/321) olduğunu göstermiştir. Bulgularımız, uygun olmayan döngü koşullarının, PVL gen amplifikasyonunda yalancı negatif ya da yalancı pozitif değerlendirmelere yol açabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, PVL araştırmalarında, çalışma sonuçlarını yorumlamadan önce, farklı primerler ve farklı bağlanma derecelerinin kullanılması uygun görünmektedir. Her çalışmada pozitif ve negatif kontrol suşlarının kullanılması ve çalışma protokolünün sadece literatür bilgilerine dayanarak değil, aynı zamanda laboratuvar deneyimleri ile optimi-zasyonu, güvenilir verilerin elde edilmesinde kritik önem taşımaktadır.