Investigation of Potentially Pathogenic Free-Living Amoebae and Their In Vivo Pathogenicity in Water Supplies of Turkey

Türkiye'deki Sularda Serbest Yaşayan Potansiyel Patojen Amipler ve Patojenitelerinin İn Vivo Olarak Araştırılması

Abstract

Free-living amoebae (FLA) are found widely in soil and water in the nature. Among them in which potentially pathogenic for humans and animals are known as "potential pathogenic free-living amoebae (PPFLA)". PPFLA are characterized as the causes of clinical manifestations leading to death especially in immunosuppressed people. Four genus of PPFLA (Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia and Sappinia) are known to be pathogenic to humans. The aims of this study were to investigate the presence of PPFLA in the water supplies in Turkey and to determine their in vivo pathogenicity. A total of 664 water samples were collected from the ponds, rivers, streams and wells found in provinces located at different regions (central, western, eastern and southeastern regions) of Turkey. These samples were initially inoculated in the monoxenic culture media and evaluated by both microscopy and polymerase chain reaction (PCR) in terms of the presence of FLA. The samples identifi ed as positive were then cultured in axenic media, the growth of amoebae that were confi rmed microscopically, were than studied with PCR for molecular characterization. The isolates that were found positive by PCR from axenic cultures were inoculated intranasally to immunocompetent and immunodefi cient (athymic) [BALB/c Rag2(-/-) gamma(c)(-/-)] BALB/c mice followed by the evaluation on the 21st day by histopathological and molecular methods to investigate their in vivo pathogenicity. In our study, 143 water samples were detected as positive in monoxenic cultures and 41 of them were detected as positive in axenic cultures. Twenty of 41 samples detected as positive in axenic culture could be continued in culture for three months. As a result of PCR using primers common to SYA, only nine have been identifi ed from 20 samples as positive. According to the result of the PCR with specifi c primers, all (n= 9) were positive for Acanthamoeba sp., eight for Sappini sp. and fi ve for Balamuthia mandrillaris, while none was observed Naegleria fowleri. Histopathologic examination revealed that both groups of mice that were infected with the nine isolates had normal brain tissue sections; but haemorrhages and mononuclear cell proliferation were determined in four immunocompetent and seven athymic animal lung sections. When the presence of parasites in tissue samples were evaluated by real-time PCR, Balamuthia was detected in at least one blood, lung, brain or nasal mucosa sample of the four immunocompetent mice, Sappinia sp. in four and Acanthamoeba sp. in seven immunocompetent mice infected with nine isolates. Additionally, seven Balamuthia sp., seven Sappinia sp. and eight Acanthamoeba sp. were detected in immunodefi cient mice. In this study, B. mandrillaris and Sappinia sp. were the fi rst isolated potentially pathogenic amoebae from water supplies located at different parts of Turkey. As a result awareness and precautions against suspicious water supplies used for drinking, daily use and swimming purposes should be treated more carefully

Özet

Serbest yaşayan amipler (SYA) doğada, toprak ve sularda yaygın olarak bulunmaktadır. Bunlar içerisinde hayvan ve insanlar için patojenite potansiyeli gösterenlere "serbest yaşayan potansiyel patojen amipler (SYPPA)" adı verilmektedir. SYPPA'nın özellikte immün sistemi baskılanmış kişilerde ölüme kadar varabilen klinik tablolara sebep olduğu bilinmektedir. İnsanlarda potansiyel patojen olduğu bilinen dört cins SYPPA (Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia ve Sappinia) bulunmaktadır. Bu çalışmada, Türkiye'deki sularda SYPPA varlığının saptanması ve izole edilen amiplerin in vivo patojenitelerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Türkiye'nin farklı bölgelerinde (Kayseri, Bingöl, Erzurum, Elazığ, Kocaeli, Diyarbakır, İzmir) bulunan gölet, akarsu, çay ve kuyulardan alınan toplam 664 su örneği dahil edilmiştir. Örnekler ilk olarak monoksenik kültür ortamına ekilmiş ve hem mikroskobik olarak hem de polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile SYA açısından değerlendirilmiştir. Pozitif olduğu belirlenen örnekler daha sonra aksenik kültür ortamına alınmış, mikroskobik olarak üremenin olduğu tespit edilen örnekler PCR ile çalışılmış ve pozitif izolatların moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Aksenik kültürden PCR ile pozitif bulunan örneklere ait izolatların in vivo patojenitesi, immün sistemi sağlam olan ve olmayan (atimik) [BALB/c Rag2(-/-) gamma(c)(-/-)] BALB/c tipi farelere intranazal amip inokülasyonu sonrası 21. günde histopatolojik ve moleküler yöntemlerle araştırılmıştır. Çalışmamızda, su örneklerinin 143'ü monoksenik kültürde, bu örneklerin de 41'i aksenik kültürde pozitif bulunmuştur. Aksenik kültürde pozitif tespit edilen 41 örneğin 20'sinin üç aylık kültürü devam ettirilebilmiştir. SYA için ortak primerler kullanılarak yapılan PCR sonucunda, 20 örnekten sadece dokuzu pozitif olarak tespit edilmiştir. Türe özgül primerler ile yapılan PCR sonucunda ise tamamı (n= 9) Acanthamoeba sp., sekizi Sappinia sp. ve beşi Balamuthia mandrillaris pozitif bulunurken, hiçbirisinde Naegleria fowleri'ye rastlanmamıştır. Histopatolojik incelemede, bu dokuz izolatla enfekte edilen her iki grup farede de beyin dokusu kesitlerinin normal olduğu; ancak immün sistemi sağlam dört ve atimik yedi hayvanın akciğer kesitlerinde hemoraji ve mononükleer hücre artışının görüldüğü saptanmıştır. Dokularda gerçek zamanlı PCR ile parazit varlığının araştırılması sonucunda; dokuz izolatla enfekte edilen immün sistemi sağlam farelerin dördüne ait kan, akciğer, beyin ve nazal mukoza örneklerinin en az birinde Balamuthia; dördünde Sappinia sp. ve yedisinde Acanthamoeba sp. saptanmıştır. Atimik farelerin ise, yedisinde Balamuthia mandrillaris, yedisinde Sappinia sp. ve sekizinde Acanthamoeba sp. pozitifl iği tespit edilmiştir. Bu çalışma ile ilk kez, ülkemizin çeşitli bölgelerindeki su örneklerinden, potansiyel patojen amiplerden olan B.mandrillaris ve Sappinia sp. izolasyonu yapılmıştır. Sonuç olarak, içme, kullanma ya da yüzme amacıyla faydalanılan şüpheli su kaynaklarının risk oluşturabileceği konusunda farkındalığın oluşması ve daha dikkatli davranılması gerektiği düşünülmektedir