Journals / Mikrobiyoloji Bülteni / 2007 / Cilt: 41 - Sayı: 3
Comparison of three different mycobacterial DNA isolation methods
- Journal
- Mikrobiyoloji Bülteni
- Pages
- 395–402
- DOI
- —
Abstract
Rapid diagnosis of mycobacterial infections is of crucial importance. For this reason molecular methods have become valuable diagnostic tools. DNA isolation step prior to polymerase chain reaction (PCR) is one of the most important steps that affect the sensitivity of the diagnostic tests. In this study, three isolationmethods which could affect the sensitivity of the PCR methods used for the diagnosis of mycobacterial infections were compared. For this reason the sensitivities of boiling method, MagNA Pure LC automated isolation system (Roche Applied Science, Germany) and Magtration 12GC (Precision System Science, Germany) automated isolation system were compared by using four different mycobacterial strains (Mycobacterium tuberculosis H37Ra standard strain, M.tuberculosis clinical isolate, M.phlei and M.smegmatis). DNAs were isolated from serial dilutions of these mycobacterial strains by using three isolation methods, and 441 base pair region of hsp65 gene was amplified by PCR. After the obtained products were run on agarose gel, it was observed that the 5 lowest dilution rates at which bands could be seen were 10 dilutions of H37Ra DNA isolated by MagNA Pure and Magtration systems. Isolation of H37Ra DNA by boiling 2 method yielded a band in 10 dilution sample. Isolation of DNA from Mycobacterium tuberculosis clinical isolate by MagNA Pure system, Magtration system and boiling 4 3 1 method provided amplification in 10 , 10 and 10 dilution samples, respectively. The 5 4 lowest dilution samples which yielded visible bands on agarose gel were 10 , 10 and 2 4 3 2 10 dilution samples for M.smegmatis strain and 10 , 10 and 10 dilution samples for M.phlei strain. The results of this study revealed that MagNA Pure system could detect smaller amounts of DNA in the sample while boiling method was not a reliable method to detect small amounts of DNA in clinical samples. Therefore it was concluded that the use of automated isolation systems could be a reliable alternative for routine PCR applications by providing both high sensitivity and standardization.
Özet
Mikobakteri enfeksiyonlarında tanının kısa bir sürede konabilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle moleküler yöntemler günümüzde değerli tanı araçları haline gelmişlerdir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) öncesinde uygulanan DNA izolasyon aşaması, kullanılan testin duyarlılığını etkileyen en önemli basamaklardan biridir. Bu çalışmada, mikobakteri enfeksiyonlarının tanısında kullanılan PCR yöntemlerinin verimliliğini etkileyebilecek üç DNA izolasyon yöntemi karşılaştırmıştır. Bu amaçla kaynatma yöntemi, "MagNA Pure LC" (Roche Applied Science, Germany) otomatize izolasyon sistemi ve "Magtration 12GC" (Precision System Science, Germany) otomatize izolasyon sisteminin duyarlılıkları, dört farklı mikobakteri susu (Mycobacterium tuberculosis H37Ra standart susu, M.tuberculosis klinik izolatı, M.phlei ve M.smegmatis) kullanılarak test edilmiştir. Bu suşların seri dilüsyonları hazırlanarak her üç yöntemle de DNA izolasyonu uygulanmış, daha sonra PCR ile tüm mikobakterilerde bulunan hsp65 genine özgül primerler kullanılarak 441 baz çiftlik bölge çoğaltılmıştır. Elde edilen ürünler agaroz jel elektroforezi ile ayrıştırdığında, bant gözlenebilen en düşük 5 dilüsyon oranı, 10 ile "MagNA Pure" ve "Magtration" sistemleriyle izolasyon yapılan H37Ra susunda saptanmıştır. H37Ra DNA'sının kaynatma yöntemi ile izolasyonunda 2 ise ancak 10 dilüsyonda bant gözlenebilmiştir. M.tuberculosis izolatında "MagNA 4 3 1 Pure" sistemi, "Magtration" sistemi ve kaynatma yöntemiyle sırasıyla 10 , 10 ve 10 dilüsyonlarda bant gözlenmiştir. M.smegmatis ve M.phlei suşlarında ise amplifikasyon 5 4 2 4 3 2 sırasıyla 10 , 10 , 10 ve 10 , 10 ve 10 dilüsyonlarında gözlenmiştir. Çalışma sonucunda, "MagNA Pure" sistemi ile daha düşük miktarlardaki DNA'nın saptanabildiği, buna karşın kaynatma yöntemiyle ancak yüksek miktarlardaki DNA'nın saptanabildiği görülmüştür. Bu nedenle, rutin PCR uygulamalarında hem daha duyarlı olmalarından dolayı hem de standardizaşyon sağlanabilmesi için, otomatize izolasyon sistemlerinin kullanılmasının uygun olacağı sonucuna varılmıştır.