Dtection and typing of human paplilloma virus by polymerase chain reaction and hybridization assay in cervical samples with cytological abnormalities

Stolojik atipi izlenen servikal örneklerde insan papilloma virusunun polimeraz zincir reaksiyonu ve hibridizasyon yöntemleriyle saptanması ve tiplendirilmesi

KORAY ERGÜNAY,Müge MISIRLIOĞLU,PINAR FIRAT,Z. Selçuk TUNCER,Serdar TUNCER,Işıl YILDIZ,Şemsettin USTAÇELEBİ

Abstract

Certain mucosa-tropic human papillomavirus (HPV) types are associated with carcinoma of the uterine cervix or its precursor lesions. In addition to cytological screening, early diagnosis and treatment of cervical carcinoma rely on sensitive detection and typing of HPV isolates. In this study, HPV detection and typing were performed in the cervical samples of patients with abnormal cytological evaluation. Forty randomly-selected cervical samples that comprise 18 ASC-US (Aypical Squamous Cells of Undetermined Significance), four AG-US (Aypical Glandular cells of Undetermined Significance), one ASC- H (Atypical Squamous Cells-can not exclude HSIL), one HSIL (High-grade Intraepithelial Lesion), 14 LSIL (Low-grade Intraepithelial Lesion), one adenocarcinoma and one squamous cell carcinoma, obtained by a commercial liquid-based cytology system (ThinPrep™ Pap Smear Method, Cytyc, USA), were included to the study. HPV-DNA detection were accomplished by L1 in-house polymerase chain reaction (PCR) performed using MY09/11 and GP5/6 primers along with a commercial real-time PCR (Heliosis™ HPV LC PCR Kit; Metis Biotechnology, Turkey) that detects HPV infections and HPV-16 via melting curve analysis. A commercial PCR-array hybridization test (Rapid HPV Genotyping MacroArray™; HybriBio Inc, Hong Kong) that can identify 21 low and high risk HPV types was employed for typing. Viral DNA was detected in 35% (14/40) and 57.5% (23/40) of the samples by MY09/11 and GP5/6 primers, respectively. All in-house PCR positive samples were also positive in the real-time PCR assay. PCR-array hybridization assay provided typing results in 95.6% (22/23) of the PCR positive samples while one LSIL sample could not be typed by any of the methods used. High risk HPV types 16, 18, 31, 45, 52, 56, 58, 59,68 (65.8%); probable high risk type 53 (13.2%), low risk types 6, 42 and 81 (21%) were identified out of a total of 38 HPV isolates. Multiple infections with more than one HPV type were identified in 45.5% (10/22) of positive samples. High/probable high risk types were detected in all single infections and all low risk isolates were present in multiple infections. HPV-16 was identified in 31.8% (7/22) by real-time PCR and in 45.5% (10/23) of positive samples by PCR-array hybridization assay. HPV-16 was observed to be the most frequently detected type (10/22, 45.5%), followed by types 53 and 81 (5/22, 22.7%); 68 (4/22, 18.2%); type 58 (3/22; 13.6%); types 31, 42 and 59 (2/22; 9.1%) and others (1/22, 4.5%). As a result our data have indicated the abundance of high risk HPV isolates and infections with multiple HPV types in that specific area.

Özet

Mukozal tropizm gösteren insan papilloma viruslarının (HPV) bazı tiplerinin servikal karsinom ya da öncül lezyonları ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Serviks kanserinin erken tanı ve tedavisinde, tarama programlarına ek olarak HPV enfeksiyonunun ve etken virus tipinin duyarlı yöntemlerle saptanması da önemli rol oynamaktadır. Bu çalışmada, servikal atipi saptanan sitoloji örneklerinde tek oturumlu ve "nested" konsensüs polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri uygulanarak HPV varlığının araştırılması, tiplendirilmesi ve HPV tip 16'nın saptanmasında ticari bir gerçek zamanlı (real-time) PCR yöntemi ile ticari bir array-hibridizasyon sisteminden elde edilen sonuçların karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya ticari bir sıvı bazlı sitolojik örnekleme sistemi (ThinPrep™ Pap Smear Method, Cytyc, ABD) ile elde edilen 18 ASC-US (Aypical Squamous Cells of Undetermined Significance), dört AG-US (Aypical Glandular cells of Undetermined Significance), bir ASC-H (Atypical Squamous Cells- cannot exclude HSIL), bir HSIL (High-grade Intraepithelial Lesion), 14 LSIL (Low-grade Intraepithelial Lesion), bir adenokarsinom ve bir skuamoz hücreli karsinom olmak üzere, rastgele olarak seçilmiş toplam 40 örnek dahil edilmiştir. HPV DNA'sının saptanması için MY09/11 ve GP5/6 primerlerinin kullanıldığı L1 "in-house" konsensüs PCR; HPV saptama/HPV-16 tiplendirmesi yapan ticari bir gerçek zamanlı (real-time) PCR sistemi (Heliosis™ HPV LC PCR Kit; Metis Biyoteknoloji, Türkiye) ve düşük/yüksek riskli 21 farklı virus tipinin tanımlanabildiği ticari bir PCR-array hibridizasyon sistemi (Rapid HPV Genotyping MacroArray™; HybriBio İne, Hong Kong) uygulanmıştır. Virusa ait DNA, MY09/11 ve GP5/6 primerleri ile, örneklerin sırasıyla %35 (14/40) ve %57.5'inde (23/40) saptanmış, konsensüs PCR ile pozitif olan örnekler gerçek zamanlı PCR ile de pozitif sonuç vermiştir. PCR-array hibridizasyon yöntemi ile pozitif örneklerin %95.6'sında (22/23) tiplendirme yapılmış, konsensüs PCR ve gerçek zamanlı PCR sonucu pozitif bir LSIL örneği, uygulanan herhangi bir yöntemle tiplendirilememiştir. Örneklerden yüksek riskli HPV tipleri 16, 18, 31, 45, 52, 56, 58, 59, 68 (%65.8); muhtemel yüksek riskli tip 53 (%13.2), düşük riskli tipler 6, 42 ve 81 (%21) olmak üzere 38 HPV izolatı tanımlanmıştır. Birden fazla HPV tipi ile çoklu enfeksiyon, pozitif örneklerin %45.5 (10/22)'inde saptanmış, tekli enfeksiyonların tamamının yüksek/muhtemel yüksek riskli HPV izolatları ile meydana geldiği ve düşük riskli tiplerin sadece çoklu enfeksiyonlarda bulunduğu izlenmiştir. HPV-16, pozitif örneklerin %31.8 (7/22)'ünde gerçek zamanlı PCR, %45 5 (10/22)'inde ise PCR-array hibridizasyon testiyle gösterilmiştir. Çalışmada en sık saptanan tip %45.5 oranıyla HPV-16 olmuş, onu tip 53 ve tip 81 (%22.7, 5/22); tip 68 (4/22, %18.2); tip 58 (3/22, %13.6); tip 31, 42, ve 59 (%9.1, 2/22) ve diğer tipler (%4.5, 1/22) izlemiştir. Sonuç olarak bulgularımız, yüksek riskli HPV tiplerinin ve çoklu enfeksiyonların sıklığına dikkati çekmektedir.