Comparison of quantitative hepatitis B virus DNA levels in serum and liver biopsy samples of chronic hepatitis B patients

Kronik hepatit B hastalarının serum ve karaciğer biyopsi örneklerinde hepatit B virus DNA düzeyinin karşılaştırılması

Abstract

Chronic hepatitis B (CHB) is an important health problem worldwide. Relapses in CHB patients, even treated, create a major problem in patient management. The aims of this study were the detection of quantitative levels of hepatitis B virus (HBV) DNA in the sera and liver biopsy specimens of CHB patients and the comparison of the results. A total of 69 patients (49 male, 20 female; age range: 19-68 years, mean age: 36.91 ±11.03 years) who were prediagnosed as CHB in the Infectious Diseases and Clinical Microbiology Department of Kocaeli University (northwestern region of Turkey) were included to this prospective study. HBV-DNA levels of all of the patients were initially measured in the routine laboratory of our hospital by using a commercial real-time polymerase chain reaction (RQ-PCR; iCycler IQ System, BioRad Laboratories) and the mean HBV-DNA level (Serum DNA #2) was detected as 5.6E+6±8.5E+6 copies/mL. The mean level of ALT in CHB patients was 79.59±69.7. In our study the HBV-DNA levels of the serum and liver biopsy specimens were also measured by using an "in-house" real-time PCR (RT-PCR) (Techne Quantica, London, UK). Nucleic acid extractions were performed with the use of QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen Inc, Hilden, Germany) according to the manufacturer's recommendations. The primers were specific for the X gene region of HBV (forward primer: 5'-TTCGCTTCACCTCTGCACG-3', reverse primer: 5'-CCCAACTCCCAGTCTTTAA-3'; probe: 5'-AATGTCAACGACCGACCTT GAGGCA-pBHQ-3'). Statistical analysis was carried out with Spearman rank analysis. With the use of "in-house" real-time PCR, mean levels of HBV-DNA were found to be 8.99E+6±3.1E+7 copies/mL in the liver biopsy samples, and 4E+6±4.4E+6 copies/ mL in serum samples (Serum DNA 1). There were significant positive correlations between the results obtained from in-house (Serum DNA 1) and commercial RT-PCR (Serum DNA 2) (r=0.300; p=0.024) methods. Although HBV-DNA levels in the liver tissues were found higher than those in serum samples, no correlation between the HBV-DNA levels of liver biopsy and serum samples (both serum DNA 1 and 2) was detected. This result was attributed to the standardization problems of in-house RT- PCR. In conclusion, liver biopsies performed at the beginning of the therapy to detect the grade of chronic liver disease, would also be searched by means of quantitative HBV-DNA levels, however, since the determination of HBV-DNA load in liver tissues may be difficult, standardized sensitive methods should be used for this purpose.

Özet

Kronik hepatit B (KHB) enfeksiyonu bütün dünyada önemli bir sağlık problemidir. KHB hastalarında tedaviye rağmen relapsların ortaya çıkması hasta yönetiminde sorun oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı, KHB hastalarında tedaviye başlarken yapılan karaciğer biyopsisi ve eş zamanlı olarak alınan kan örneklerinde kantitatif olarak hepatit B virusu (HBV) DNA miktarının saptanması ve karşılaştırılmasıdır. Çalışmaya, Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Enfeksiyon Polikliniği'ne başvuran KHB ön tanısı almış 69 hasta (49 erkek 20 kadın; yaş aralığı: 19-68 yıl, yaş ortalaması: 36.91 ±11.03 yıl) dahil edilmiştir. Tüm hastaların serum HBV-DNA düzeyleri, hastanemiz rutin laboratuvarında ticari bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) (RQ-PCR; iCycler IQ System, BioRad Laboratories) ile çalışılmış ve ortalama serum HBV- DNA (Serum DNA 2) miktarı 5.6E+6±8.5E+6 kopya/ml olarak belirlenmiştir. Hastaların ortalama ALT düzeyleri ise 79.59±69.7'dir. Çalışmamızda hastaların serum ve karaciğer dokusundaki HBV-DNA düzeyleri ayrıca "in-house" RT-PCR (Techne Quantica, Londra) ile araştırılmıştır. Örneklerden nükleik asit ekstraksiyonu, DNA Mini Kit (QIAamp, QIAGEN İne, Hilden, Almanya) ile yapılmış ve HBV X genini hedefleyen primerler (F-5'-TTCGCTT CACCTCTGCACG-3' ve R- 5'-CCCAACTCCCAGTCTTTAA-3'; probe: 5'-FAM-AATGTCAAC GACCGACCTTGAGGCA-p-BHQ-3') kullanılmıştır. İstatistiksel değerlendirmede Spearman korelasyon analizi uygulanmıştır. "İn-house" RT-PCR yöntemiyle KHB'li hastaların serumlarındaki HBV-DNA (Serum DNA 1) düzeylerinin ortalama değeri 4E+6±4.4+6 kopya/ml; karaciğer biyopsi dokularındaki HBV-DNA düzeylerinin ortalama değeri ise 8.99E+6±3.1E+7 kopya/ml olarak saptanmıştır. Hasta serumlarında hem ticari hem de "in-house" RT-PCR yöntemleriyle alınan HBV-DNA sonuçları arasında (sırasıyla, Serum DNA 2 ve Serum DNA 1) anlamlı pozitif bir korelasyon olduğu görülmüştür (r=0.300; p=0.024). Karaciğer dokusunda saptanan HBV-DNA düzeylerinin serum düzeylerinden daha yüksek olduğu izlenmiş, ancak serum HBV-DNA 1 ve 2 değerleri ile karaciğer HBV-DNA düzeyleri arasında korelasyon saptanamamıştır (Serum DNA 1: r=0.104, p=0.404; Serum DNA 2: r=-0.135, p=0.321). Bu durumun "in-house" RT-PCR yöntemindeki standardizasyon sorunundan kaynaklanabileceği düşünülmüştür. Sonuç olarak, tedaviye başlarken hastalara karaciğer biyopsisi yapılmasının, kronik karaciğer hastalığının derecesini belirlemek yanında, bu örneklerde HBV DNA'sının kantitatif olarak saptanmasının da yararlı olabileceği, ancak bu amaçla standardize edilmiş duyarlı yöntemlerin kullanılmasının gerekli olduğu kanısına varılmıştır.