Adaptation of a sensitive dna extraction method for detection of entamoeba histolytica by real-time polymerase chain reaction

Dışkı örneklerinde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile entamoeba hıstolytıca saptanmasında duyarlı bir dna saflaştırma protokolü uyarlanması

Abstract

This study was aimed to adapt a sensitive DNA extraction protocol in stool samples for real-time polymerase chain reaction (PCR) detection of Entamoeba histolytica which causes important morbidity and mortality worldwide. Stool extraction is a problematic step and has direct effects on PCR sensitivity. In order to improve the sensitivity of E.histolytica detection by real-time PCR, “QIAamp DNA stool minikit (Qiagen, Germany)” was modified by adding an overnight incubation step with proteinase K and sodium dodecyl sulfate (SDS) in this study. Three different extraction methods [(1) original method, (2) cetyltrimethyl-ammonium bromide (CTAB) method, (3) modified method] were evaluated for effects on sensitivity in real-time quantitative PCR (Artus RealArt TM E.histolytica RG PCR Kit, Qiagen Diagnostics, Germany). For this purpose, several concentrations of standard E.histolytica DNA were spiked in parasite-free stool samples and three different extraction protocols were performed. Detection sensitivities of “QIAamp DNA stool minikit” was found 5000 copies/ml and of CTAB method was found 500 copies/ml. Detection sensitivity of the extraction was improved to 5 copies/mL by modified “QIAamp DNA stool minikit” protocol. Since detection sensitivities of nucleic acid extraction protocols from stool samples directly affect the sensitivity of PCR amplification, different extraction protocols for different microorga- nisms should be evaluated.

Özet

Bu çalışmada, tüm dünyada önemli morbidite ve mortaliteye neden olan Entamoeba histolytica’nın dışkı örneklerinden tanısında kullanılan gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için duyarlı bir DNA saflaştırma protokolü uyarlanması amaçlanmıştır. Dışkı örneklerinden nükleik asit saflaştırılması, PCR yönteminde sorun yaratan ve PCR duyarlılığını doğrudan etkileyen bir basamaktır. Çalışmamızda, E.histolytica saptanmasında gerçek zamanlı PCR duyarlılığının artırılması için, “QIAamp DNA stool minikit (Qiagen, Almanya)” protokolü uyarlanarak, bir gece boyunca proteinaz K ve sodyum dodesil sülfat (SDS) inkübasyonu eklenmiştir. Üç farklı DNA saflaştırma protokolünün [(1) özgün yöntem, (2) setiltrimetil amonyum bromür (CTAB) yöntemi, (3) uyarlanmış yöntem] duyarlılık üzerine etkinlikleri gerçek zamanlı kantitatif PCR sisteminde (Artus RealArt TM E.histolytica RG PCR Kit, Qiagen Diagnostics, Almanya) saptanmıştır. Bu amaçla, saflaştırma öncesinde parazit bulunmadığı bilinen dışkı örneklerine farklı sulandırımlarda standart E.histolytica DNA’sı karıştırılmış ve saflaştırma yöntemleri ayrı ayrı uygulanmıştır. “QI-Aamp DNA stool minikit” uygulamasıyla saptama duyarlılığı 5000 kopya/ml, CTAB yöntemiyle saptama duyarlılığı 500 kopya/ml bulunmuştur. Uyarlanmış “QIAamp DNA stool minikit” uygulamasıyla ise saptama duyarlılığı 5 kopya/ml’ye yükseltilmiştir. PCR duyarlılığını doğrudan etkileyen dışkıdan nükleik asit saflaştırma protokollerinin saptama duyarlılıkları, PCR ile saptanacak her mikroorganizma için değerlendirilmelidir.