Expression of hepatitis B virus core antigen gene region in yeast cell

Abstract

In this study, the core antigen (HBcAg) gene region of hepatitis B virus (HBV) was transformed and expressed into an eukaryotic expression vector by recombinant DNA technology in order to obtain the protein used in anti-HBc tests which is being one of the most important marker for the serodiagnosis of HBV infections. For this purpose, HBV-DNA positive patient sera were used as the source of viral nucleic acids, and the primers coding HBcAg gene region have been designed. After the amplification of HBcAg gene region by polymerase chain reaction (PCR), the amplicons purified by Invisorb Spin Rapid PCR Kit” (Invitek, Germany), were cloned to pYES2.1 plasmid via the TOPO® TA expression kit (Invitrogen, USA) and this plasmid was transformed to competent bacteria (TOPO 10F’ Escherichia coli) by CaCl 2 method. After competent bacteria were grown on LB (Lysogeny Broth) agar media supplemented with ampicillin, the plasmid “pYES2.1 + HBcAg” were isolated and transformed to Saccaromyces cerevisiae via the “S.c. EasyComp Transformation Kit” (Invitrogen, USA). Finally, the expression of HBcAg by the yeast was confirmed with the use of in house ELISA method. Since the diagnostic kits used in our country for hepatitis B serology are usually imported products, this creates a great economical burden. Thus, the experience and knowledge that builds up following such studies will help to produce our own diagnostic products using our equity.

Özet

Bu çalışmada, hepatit B virusu (HBV) enfeksiyonlarının tanı ve izleminde önemli bir serolojik belirleyici olan anti-HBc testinde kullanılan gerekli proteini elde etmek amacıyla, HBV kor antijeni gen bölgesinin rekombinant DNA teknolojisi ile ökaryotik ekspresyon vektörüne yerleştirilmesi planlanmıştır. Çalışmada HBV DNA’sı pozitif hasta serumları kullanılmış ve HBc antijenini kodlayan genin primerleri dizayn edilerek, HBcAg gen bölgesi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmıştır. Daha sonra “Invisorb Spin Rapid PCR Kit” (Invitek, Almanya) ile saflaştırılan amplikonlar, TOPO® TA ekspresyon kiti (Invitrogen, ABD) ile pYES2.1 plazmidine klonlanmış ve bu plazmid CaCl 2 yöntemiyle kompetan bakteriye (TOPO 10F’ Escherichia coli) transforme edilmiştir. Kompetan bakteri, ampisilinli LB (Lysogeny Broth) agarda çoğaltıldıktan sonra “pYES2.1 + HBcAg” plazmidi izole edilmiş ve “S.c. EasyComp transformasyon kiti” (Invitrogen, ABD) ile Saccaromyces cerevisiae’ya transforme edilmiştir. Son aşamada, HBcAg’nin maya tarafından eksprese edildiği “in house” ELISA yöntemiyle doğrulanmıştır. Ülkemizde hepatit B’nin serolojik tanısında kullanılan kitlerin büyük çoğunluğunun ithal ürünler olduğu ve bu durumun ülke ekonomisine getirdiği yük dikkate alındığında, bu ve benzeri çalışmalarla elde edilen deneyim ve bilgi birikiminin, kendi öz kaynaklarımızla elde edilecek ürünlere dönüşmesinde önemli katkısı olacağı düşünülmüştür.