DNA extraction and identification of trichophyton rubrum by real-time polymerase chain reaction from direct nail scraping specimens of patients with onycomycosis

Onikomikozlu olguların direkt tırnak kazıntı örneklerinden DNA izolasyonu ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile trichophyton rubrum tanımlanması

Abstract

Trichophyton rubrum is the most frequently encountered dermatophyte species causing onichomycosis. The routine diagnosis of dermatophytes depends on the direct microscopic examination (DME) and culture methods, however due to the phenotypic identification problems related to those agents, the molecular methods come into question. The aim of this study was to evaluate the diagnostic performance of real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) for the identification of T.rubrum by comparing to DME and culture methods, from nail samples of patients with the complaints of onychomycosis. A total of 90 patients of whom 58 were male who were admitted to the dermatology outpatients clinics of our hospital with the complaints of color/shape changes in the nails and thickening of the nail, were included in the study, together with the 20 healthy volunteer subjects as controls. The nail scraping samples obtained from the patients and controls were examined with direct microscopy using 15% potassium hydroxide, dimethyl sulphoxide and chlorazole black mixture and cultivated onto Sabouraud dextrose agar with and without cycloheximide. For DNA isolation, after the disruption of nail samples with a steel tool, phenol-chloroform-isoamyl alcohol purification method were used. The amplification and demonstration of the T.rubrum DNA have been performed by using specific primers and probes following TaqMan protocol of RT-PCR (LightCycler-Roche, USA) method. Seventy-two of the patients yielded positive and 18 yielded negative results with DME. Growth of molds was detected in the cultures of 20 (27.8%) of the 72 DME positive patients and all of the isolates were identified as T.rubrum. No fungal growth was seen in the samples of 18 patients who were DME negative. In DME positive group, 67 (93%) patients were found to be positive in RT-PCR, while 8 (44.4%) patients were RT-PCR positive in DME negative group. All of the culture positive samples (n= 20) were also found positive in RT-PCR. All of the samples from the control group with healthy nails yielded negative results in DME, culture and RT-PCR methods. The performance of PCR method were compared to direct microscopy that had higher sensitivity than culture and the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of RTPCR assay were estimated as 93%, 56%, 89% and 67%, respectively. In conclusion RT-PCR was thought to be an efficient and rapid assay in the diagnosis of onichomycosis. Although RT-PCR seems more expensive than culture, for the centres which already have support for the molecular methods, the difference in total cost doesn’t count much. In conclusion, by the use of molecular methods DNA isolation was successfully done from a relatively difficult clinical specimen, namely nail scraping, a protocole that could easily be applied in routine laboratory was established and species-level identification in a short time was accomplished in this study.

Özet

Trichophyton rubrum, onikomikoz etkenleri arasında en sık karşılaşılan dermatofit türlerindendir. Dermatofitlerin rutin tanısı direkt mikroskobik inceleme (DMİ) ve kültür yöntemlerine dayanmakla birlikte, etkenin fenotipik olarak tanımlanmasındaki sorunlar, moleküler yöntemlerin gündeme gelmesine neden olmuştur. Bu çalışmada, onikomikoz şikayetleri olan hastaların tırnak örneklerinde, T.rubrum’a özgül gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yönteminin tanısal performansının, direkt mikroskopi ve kültür yöntemleri ile karşılaştırılması ve erken tanıya olan katkısının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, hastanemizin dermatoloji polikliniğine el ve ayak tırnaklarında renk/şekil değişikliği ve kalınlaşma şikayetleriyle başvuran 58’i erkek 90 hasta ile kontrol olarak tamamen sağlıklı 20 gönüllü dahil edilmiştir. Hasta ve kontrollerden alınan tırnak kazıntı örnekleri, %15 potasyum hidroksit, dimetil sülfoksit ve klorazol siyahı karışımı ile direkt mikroskopik olarak incelenmiş ve siklohekzimit içeren ve içermeyen Sabouraud dekstroz agarda kültürleri yapılmıştır. DNA izolasyonu için tırnak örnekleri çelik bir parçalayıcı ile ezilmiş ve fenol-kloroform-izoamil alkol saflaştırma yöntemi uygulanmıştır. T.rubrum DNA’sının çoğaltılması ve gösterilmesi, özgül primerler ve problarla TaqMan protokolü kullanılarak RT-PCR yöntemi (LightCycler-Roche, ABD) ile yapılmıştır. DMİ ile 72 hasta pozitif, 18 hasta ise negatif sonuç vermiş; DMİ pozitif olan hastaların %27.8 (20/72)’inin kültüründe dermatofit üremesi olmuş ve tüm izolatlar T.rubrum olarak tanımlanmıştır. DMİ negatif bulunan 18 örneğin hiçbirisinin kültüründe üreme olmamıştır. DMİ ile pozitif saptanan 72 hastanın 67 (%93)’si ve DMİ negatif bulunan 18 hastanın 8 (%44.4)’i PCR ile pozitif sonuç vermiştir. Kültüründe T.rubrum üretilen tüm örnekler (n= 20) PCR ile de pozitif bulunmuştur. Sağlıklı tırnaklara sahip 20 gönüllüden alınan örneklerin hepsi DMİ, kültür ve PCR ile negatif sonuç vermiştir. PCR yönteminin performansı, kültürden daha yüksek duyarlılığa sahip olan DMİ sonuçları ile karşılaştırılmış ve PCR’nin duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif prediktif değerleri sırasıyla; %93, %56, %89 ve %67 olarak hesaplanmıştır. Çalışmamızda, RT-PCR’nin tanı açısından etkin ve hızlı bir yöntem olduğu izlenmiş; maliyet açısından da her ne kadar pahalı gibi görünse de alt yapısı hazır merkezlerde kültür ile arasında önemli bir fark olmayacağı düşünülmüştür. Sonuç olarak, dermatofitlerin tanısında moleküler bir yöntem kullanılarak tırnak kazıntısı gibi zor bir klinik örnekten DNA elde edilebilmiş, rutin uygulamada kullanılabilecek bir protokol oluşturulmuş ve kısa sürede tür tanımı yapılabilmiştir