Investigation of baseline antiviral resistance in treatment-naive chronic hepatitis B cases

Tedavi naif kronik hepatit B olgularında bazal antiviral direncin araştırılması

KORAY ERGÜNAY,Evrim AKSOY KAHRAMANOĞLU,HALİS ŞİMŞEK,ALPASLAN ALP,BURÇİN ŞENER,Gonca TATAR,Dürdal US,AYŞE GÜLŞEN HASÇELİK

Abstract

Naturally-occuring mutations associated with resistance to nucleoside/nucleotide analogues (NA) can be detected in a group of treatment-naive individuals chronically infected with hepatitis B virus (HBV). Genotypic resistance testing prior to the initiation of NA therapy may facilitate the selection of optimal drug regime and help to prevent early emergence of clincal resistance. In this study, presence of resistance mutations in treatment-naive individuals with chronic hepatitis B (CHB) was investigated in Hacettepe University Hospital, a referral center in Ankara province, Turkey. A total of 42 patients (17 fe- male, 25 male; age range: 18-62 years) diagnosed as CHB were enrolled in the study with informed con- sent. All of the patients were negative for hepatitis C and D viruses and human immunodeficiency virus coinfections, and none had a history of interferon or NA treatment. HBV viral load, HBV markers and he- patic enzymes in patients were determined via standardized commercial assays. For the detection of NA resistance mutations, a partial sequence of approximately 250 nucleotides, harboring the frequently-ob- served sites for NA resistance was amplified via nested PCR and characterized by direct sequencing of the amplicons. The sequences were handled and interpreted for the presence of mutations via various softwares and a web-based virtual phenotyping tool. Well-characterized sequences were obtained in 30 out of 42 samples (71.4%). All circulating HBV strains were observed as genotype D. Nucleotide variati- ons were detected in 19 individuals (63.5%) that comprise silent mutations without amino acid substi- tution in 8 (26.6%), mutations with undetermined significance in 7 (23.3%) and mutations associated with NA resistance in 3 (10%) patients. Mutations conferring resistance to entecavir + lamivudine (S202G, M204V, L180M, T184N) were identified in one patient whereas L180P, A181Q and A194V subs- titutions associated with probable lamivudin + adefovir and tenofovir resistance, respectively, were de- tected in other patients. All patients with resistance mutations were HBsAg and HBeAg positive, anti-HBe negative and had viral loads exceeding 3 x 107 IU/ml. In two patients, the route for HBV transmission was vertical. Since no follow-up samples were available from individuals with resistance mutations, alte- rations in serological markers, viral load and mutation patterns could not be monitored. In conclusion, the presence of NA resistance mutations were revealed in treatment-naive CHB cases in a referral hospi- tal in Turkey. The impact and cost-effectivity of detecting naturally-occuring resistance mutations for cli- nical follow-up prior to the antiviral therapy need to be elucidated by prospective studies.

Özet

Hepatit B virusu (HBV) ile kronik olarak enfekte ve herhangi bir tedavi almamış (naif) olguların bir kısmında, nükleozid/nükleotid analoğu (NA) bileşiklere karşı antiviral direnç ile ilişkili mutasyonlar saptanabilmektedir. NA ile antiviral tedavi verilmeden önce yapılacak genotipik direnç analizi, optimal tedavi rejiminin seçimi ve erken dönem klinik direncin önlenmesini mümkün kılabilir. Bu çalışmada, kronik hepatit B (KHB) enfeksiyonu tanısı ile takip edilen ve antiviral tedavi almamış olgularda HBV ilaç direnci mutasyonlarının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Anabilim Dalı Gastroenteroloji Ünitesinde KHB tanısı almış; hepatit C ve D virusu (HCV) ve insan immün yetmezlik virusu (HIV) koenfeksiyonu olmayan, interferon ya da NA ile tedavi başlanmamış 42 olgu (17 kadın, 25 erkek; yaş aralığı: 18-62 yıl), bilgilendirilmiş onam ile dahil edilmiştir. Olgularda HBV viral yükü, serolojik göstergeler ve karaciğer enzimleri, standardize ticari sistemlerle saptanmıştır. HBV ilaç direnci ile ilişkili mutasyonların belirlenmesi için, viral polimeraz geninde sık kullanılan NA ilaçlara karşı direnç mutasyonlarının yerleştiği yaklaşık 250 nükleotidlik kısım “nested” PCR ile çoğaltılarak amplikonlar doğrudan DNA dizi analizi ile incelenmiştir. Elde edilen diziler çeşitli yazılımlar ve web tabanlı bir sanal feno- tiplendirme arabirimi kullanılarak bilinen ilaç direnç mutasyonları açısından değerlendirilmiştir. İncelenen 42 örneğin 30 (%71.4)’unda kısmi diziler elde edilmiş ve tüm olgular genotip D olarak saptanmıştır. Olguların 19 (%63.3)’unda çeşitli nükleotid değişiklikleri izlenmiş; bunlar 8 (%26.6) olguda aminoasit değişikliğine neden olmayan sessiz mutasyonlar, 7 (%23.3) olguda ise önemi bilinmeyen mutasyonlar olarak değerlendirilmiştir. Toplam 3 (%10) olguda ise antiviral direnci ile ilişkili mutasyonlar saptanmıştır. Bu mutasyonlar; bir olguda entekavir + lamivudin (S202G, M204V, L180M, T184N), bir olguda muhtemel lamivudin + adefovir (L180P, A181Q), bir olguda ise muhtemel tenofovir direnci (A194V) şeklinde belir- lenmiştir. Mutasyon saptanan tüm olgular HBsAg ve HBeAg pozitif, anti-HBe negatif olup HBV viral yükü 3 x 107 IU/ml’nin üstündedir. İki olguda vertikal bulaş söz konusu iken, bir olguda bulaş yolu belirlenememiştir. Olgulardan takip örneği elde edilmesi mümkün olmadığından, izlenen mutasyon profili, serolojik göstergeler ve klinik gidiş ile ilgili değişiklikler izlenememiştir. Sonuç olarak, merkezimizde antiviral tedavisi almamış KHB’li olgularda dirençle ilişkili mutasyonların varlığı gösterilmiştir. Kronik HBV enfeksiyonlarında genotipik direnç testlerinin tedavi öncesi yeri, klinik takibe katkısı ve maliyet etkinliği, prospektif çalışmalarla açıklık kazanacaktır.