Evaluation of a newly-developed ready-to-use commercial PCR kit for the molecular diagnosis of francisella tularensis

Francisella tularensis’in moleküler tanısında yeni geliştirilen kullanıma hazır ticari PCR kitinin etkinliğinin değerlendirilmesi

Abstract

Tularemia is a rare zoonotic infection, however, considerations of tularemia as a biological weapon and several recent major epidemics have caused renewed interest in this disease. Laboratory diagnosis of tularemia is done in the presence of appropriate epidemiological data, by the demonstration of specific antibodies in the serum samples obtained with 1-2 week intervals following the development of symp- toms. It is an a posteriori analysis with limited use for prompt diagnosis of the patient during the early symptomatic phase and deliberate release of biological agents. Limitations in both culture and serology have led to substantial research in the development of new diagnostic techniques. Several PCR methods for tularemia have been developed, both for conventional and real-time polymerase chain reaction (rtPCR). However, PCR methods are hard to be deployed in remote endemic areas that lack sufficient infrastructure. Recently a “Toolbox” which includes all instruments, equipments and solutions [DNA4U® Bacteria Genomic DNA Isolation Kit, CubeCycler® (Personal Thermal Cycler), PCR4U® Bioterrorism Agents Detection Kit, electrophoresis tank, power supply, ready-agarose gel and electrophoresis buffer] necessary for conventional PCR, was developed for the identification of bioterrorism agents in the field. In this study we aimed to evaluate the efficacy of a ready-to-use commercial PCR kit (Nanobiz, Ankara, Turkey) targeting the tul4 gene, for the diagnosis of tularemia and to compare the results with an in-house conventional PCR and a rtPCR test. We applied the assay to a collection of four F.tularensis standard strains, 15 field isolates (from humans, animals, water), 13 non-Francisella strains which are phylogenetically related to F.tularensis and a total of 60 lymph node aspirates obtained from suspected tularemia cases. Compared to the in-house PCR method used in our laboratory, the sensitivity, specific- ity, positive and negative predictive values of Nanobiz PCR Toolbox assay were found to be 100%. The lowest detection limit of this method was determined as 100 genomic equivalent per PCR reaction mix. The new PCR kit is a rapid and accurate alternative to the conventional PCR methods since the toolbox includes all of the required chemicals, accessories and equipments. This ready-to-use PCR assay was appraised to be a valuable diagnostic tool for the detection of F.tularensis in the outbreak settings particularly in remote areas with limited resources.

Özet

Tularemi, nadir görülen bir zoonoz olmasına karşın, biyolojik silah olarak değerlendirilmesi ve son yıllarda ortaya çıkan salgınlar nedeniyle yeniden önem kazanan bir enfeksiyon olmuştur. Tulareminin laboratuvar tanısı, uygun epidemiyolojik verilerin varlığında semptomların başlangıcından sonra 1-2 hafta arayla alınan serum örneklerinde etkene karşı gelişen antikorların gösterilmesiyle konulmaktadır. Ancak bu yöntem, semptomların yeni başladığı hastalığın erken döneminde ve biyolojik harp ajanların kasıtlı salınması durumlarında, hızlı tanı açısından sınırlı kullanıma sahiptir. Kültür ve serolojideki sınırla- malar yeni tanı tekniklerinin gündeme gelmesine yol açmıştır. Tulareminin hızlı tanısına yönelik olarak, çeşitli konvansiyonel ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (rtPCR) yöntemleri geliştirilmiştir. Ancak PCR yöntemlerinin, tularemi gibi hastalığın endemik olarak görüldüğü yeterli altyapısı olmayan kırsal bölgelerdeki merkezlerde uygulanabilmesi zordur. Ülkemizde biyolojik harp maddelerinin tanısına yönelik olarak sahada kullanılmak amacıyla konvansiyonel PCR için gerekli tüm cihaz, ekipman ve bile- şenlerini [DNA4U® Bakteri Genomik DNA İzolasyon Kiti, CubeCycler® (Kişisel ısı döngü cihazı), PCR4U® Biyoterörizm Ajanlar Tespit Kiti, elektroforez tankı, güç kaynağı, agaroz jel elektroforez tamponu] içeren bir “Araç Kutusu (Toolbox)” geliştirilmiştir. Bu çalışmada, tularemi tanısında tul4 genini hedefleyen kullanıma hazır F.tularensis PCR kitinin (Nanobiz, Ankara, Türkiye) etkinliğinin araştırılması ve sonuçların “in-house” konvansiyonel ve rtPCR testi ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, dört Francisella spp. standart suşunun genomik DNA’sı, 15 Francisella spp. saha (insan, hayvan, su) izolatı, filogenetik olarak F.tularensis ile ilişkili 13 bakteri türüyle tularemi ön tanılı 60 olgudan alınan lenf nodu aspirat örnekleri çalışmaya alınmıştır. “In-house” PCR yöntemi ile karşılaştırıldığında Nanobiz PCR kitinin duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif prediktif değerleri %100 olarak bulunmuş; en düşük saptama sınırı her bir reaksiyon tüpü için 100 genomik ekivalan olarak saptanmıştır. PCR için gerekli tüm kimyasallar, cihaz ve ekipmanları içeren kullanıma hazır PCR tanı sistemi laboratuvarlarda uygulanacak olan konvansiyonel PCR’ye göre hızlı ve doğru bir alternatiftir. Sonuç olarak, kullanıma hazır PCR kiti sınırlı kaynakların söz konusu olduğu uzak bölgeleri etkileyen tularemi salgınlarında F.tularensis tanısı için değerli bir tanı aracı olarak değerlendirilmiştir.