The value of PCR Method in the species-level identification of a mucoid Salmonella sp. strain isolated from the urine culture a of a case with asymptomatic nephrolithiasis

Nefrolitiazisli asemptomatik bir olgunun idrar kültüründen izole edilen mukoid Salmonella sp. suşunun tür düzeyinde tanımlanmasında PCR yönteminin değeri

Abstract

Colonies of the Salmonella strains usually show a smooth (S) character. Therefore, Salmonella strains producing mucoid colony are very rarely encountered in the literature. Identification of the mucoid Salmonella strains to the species level is difficult via conventional methods, since the mucus layer does not allow the bacterium to respond to the antigenic reactions. In this study we aimed to emphasize the identification of Salmonella serotypes by the polymerase chain reaction (PCR) when rough (R) or mucoid (M) Salmonella isolates are encountered in the laboratory. The urine culture of a 17-year-old female patient revealed growth of 100.000 cfu/mL gram-negative bacilli in mucoid colony morphology. The isolate was identified as Salmonella sp. by biochemical tests and Vitek 2 (bioMérieux, France) automated identification system. Agglutination tests showed negative reaction with the known antiserums. Absence of agglutination was attributed to the mucoid character of the isolate. Identification of the Salmonella sp. was confirmed by Vitek MS MALDI-TOF (bioMérieux, France) analysis method, however, the serotype of the strain could not be identified. In order to verify that the mucoid colony was Salmonella spp., species-specific PCR was performed using invA primers, and Salmonella sp. identification was verified by observing a 284 base-pair (bp) PCR amplicon. Subsequently, serogrouping was done by multiplex-PCR (mPCR), which could identify the O:B (O:4), O:C1 (O:7), O:C2-C3 (O:8), O:D (O:9, O:9,46, O:9,46,27), and O:E (O:3,10, O:3,19) somatic antigens. It was detected that the mucoid Salmonella sp. formed a band of approximately 615 bp in size and took place in group D. Another mPCR directed towards O:D1(O:9) and O:E1(3,10) somatic antigens to detect subgroups of group D mucoid Salmonella spp., revealed that the isolate formed a DNA band of approximately 624 bp in size and took place in group D1 which is usually isolated from human. Modified version of another mPCR was used to determine phase-1 flagellar antigen of common Salmonella serovars, as well as to determine the phase-1 flagellar antigen of mucoid Salmonella spp. in group D1. Thus, the isolate was serotyped as Salmonella Enteritidis (1.9,12:g,m:-). Antibiotic susceptibility test performed by disc diffusion method in line with the recommendations of CLSI, revealed that the isolate was susceptible to ampicillin, ciprofloxacin, ceftriaxone, trimethoprim-sulfamethoxazole and chloramphenicol. In conclusion, PCR is a reliable and rapid alternative method that contributes to the conventional serotyping of Salmonella when rough or mucoid strains that lack somatic and flagellar antigens, are isolated.

Özet

Salmonella cinsinin üyesi olan bakterilerin koloni yapıları genellikle düzgün (smooth, S) özellik göstermektedir. Bu nedenle literatürde mukoid görünümde koloni oluşturan Salmonella suşlarına çok nadiren rastlanmaktadır. Mukoid yapıya sahip olan suşların tür düzeyinde tanımlanması konvansiyonel yöntemlerle zor olmaktadır; zira mukus tabakası bakterinin antijenik reaksiyonlara tepki vermesini engellemektedir. Bu çalışmanın amacı, kaba (rough, R) veya mukoid (M) formda Salmonella izolatları ile karşılaşılan durumlarda polimeraz zincir reaksiyonu ile serotiplendirmenin hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu vurgulamaktır. Hastanemizde nefrolitiazis tanısı ile takip edilen 17 yaşındaki bir kadın hastanın idrar kültüründe 100.000 cfu/ml mukoid koloni oluşturan gram-negatif basil üremiştir. İzolat, biyokimyasal testler ve Vitek 2 (bioMérieux, Fransa) otomatize sistemi ile Salmonella sp. olarak tanımlanmış, bilinen antiserumlarla yapılan aglütinasyon testlerinde negatif sonuç alınmıştır. İzolatın mukoid olmasından dolayı aglütinasyonun oluşamadığı düşünülmüştür. Tanı, Vitek MS MALDI-TOF (bioMérieux, Fransa) analiz yöntemi ile de Salmonella sp. olarak doğrulanmış, ancak yine tür düzeyinde tanımlama yapılamamıştır. Mukoid koloninin Salmonella sp. olduğu, invA primerleri ile yapılan cinse özgül PCR yönteminde yaklaşık 284 baz çifti (bç) büyüklüğünde PCR amplikonunun oluşması sonucu doğrulanmıştır. Ardından, O:B (O:4), O:C1 (O:7), O:C2-C3 (O:8), O:D (O:9, O:9,46, O:9,46,27), O:E (O:3,10, O:3,19) somatik antijenlerinin tespit edilebildiği bir multipleks PCR (mPCR) ile serogruplandırma yapılmıştır. Mukoid Salmonella türünün yaklaşık 615 bç büyüklüğünde bant oluşturduğu ve D grubu içinde yer aldığı tespit edilmiştir. Bu suşun, insanlardan sıklıkla izole edilen D1 grubunda yer alıp almadığını tespit etmek için, O:D1(O:9) ve O:E1(3,10) somatik antijenlerinin belirlenebildiği bir diğer mPCR uygulanmış ve yaklaşık 624 bç büyüklüğünde oluşturduğu bant ile izolatın D1 grubunda yer aldığı belirlenmiştir. D1 grubunda yer alan mukoid Salmonella türünün faz-1 flajellar antijenlerinin belirlenmesi için uygulanan mPCR sonucu, izolat Salmonella Enteritidis (1,9,12:g,m:-) olarak tiplendirilmiştir. Disk difüzyon yöntemi ile CLSI’nın önerilerine uygun olarak yapılan antibiyotik duyarlılık testinde izolatın ampisilin, siprofloksasin, seftriakson, trimetop- rim-sülfametoksazol ve kloramfenikole duyarlı olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak, somatik, flajellar antijenlerin eksprese edilmediği, kaba veya mukoid formda Salmonella izolatları ile karşılaşılan durumlarda, PCR yönteminin hızlı ve güvenilir bir alternatif yöntem olarak, konvansiyonel serotiplendirmeye yardımcı olabileceği ortaya konmuştur.