Demonstration of β-1,2 mannan structures expressed on the cell wall of candida albicans yeast form but not on the hyphal form by using monoclonal antibodies

Candida albicans maya hücre duvarında eksprese edilip hif duvarında edilmeyen β-1,2 mannan yapılarının monoklonal antikorlar ile gösterilmesi

Abstract

Candida albicans is a polymorphic fungus that may be observed as both commensal and opportunistic pathogen in humans. As one of the major components of Candida cell wall structure, mannan plays an important role in the fungus-host cell interaction and in virulence. The ability to switch from yeast to hypha form of microorganism is crutial in the development of C.albicans infections. Hyphal form has different antigenic properties compared to yeast form and structural changes occur in the yeast cell wall during transition from yeast to hypha form. Although there are several factors associated with this transition process, sufficient information is not available. The aim of this study was to investigate the change of configuration in mannan structure found in C.albicans cell wall by using monoclonal antibod- ies. C.albicans (NIHA 207) serotype A strains were used as test strains throughout the study, together with Salmonella choleraesuis 211 and Salmonella infantis as controls with similar cell wall structures to that of C.albicans. Cultures were maintained on YPD-agar medium by incubating at 28°C for yeast forms, and on YPD-broth medium in a shaking incubator at 37°C for 3-4 hours for the growth of hyphal forms. Cells were harvested in the exponential phase, and after being washed, the mannan content from C.albicans were extracted from pellet by heating in 20 mM sodium citrate buffer for 90 minutes at 125oC. Hybridoma technique was used for the production of monoclonal antibodies. After immunizing the Balb/C mice with antigen, the splenocytes were harvested and fusion was performed between spleen cells and F0 myeloma cells. The clones grown in HAT medium were screened for the presence of antibody producing hybrid cells by ELISA method. The antibody isotypes were determined by using a commercial kit (Pierce Biotechnology, ABD). The culture supernatants which contained monoclonal antibodies were collected and purified according to the ammonium sulphate method. Sandwich ELISA and immunofluo- rescence (IF) methods have been used to detect the experimental reactions. In our study, highly specific class IgM murine monoclonal antibodies (mAb-2B7) against C.albicans yeast cell wall were obtained from clone 2B7. These antibodies cross-reacted with S.choleraesuis 211 and S.infantis bacteria sharing similar cell wall structure of C.albicans. The existence of mannan β-1,2 bonds on the surface of C.albicans yeast form was confirmed with a commercial monoclonal antibody (mAb-ACMK-1; Matriks Biotek®, Turkey) specific for those bonds. Besides, mAb-ACMK-1 interacted with C.albicans yeast form and gave intense fluorescence (high positive reaction) in IF method, but no fluorescence (negative) was detected with hyphal form. This data, obtained for the first time with this study, indicates that the mannan β-1,2 bonds are either found infrequently or none in the fungal hyphal wall. Although both monoclonal antibodies recognize the mannan antigen, mAb-2B7 reacted with S.choleraesuis 211, while mAb-ACMK-1 did not, due to the difference of epitope specificity. In conclusion, monoclonal antibodies may facilitate the char- acterization of antigenic structures of Candida, which will lead for the identification of new determinants that may increase the sensitivity and specificity of commercial tests used for mannan detection in serum.

Özet

Candida albicans, insanda hem kommensal hem de fırsatçı patojen olarak bulunabilen polimorfik bir maya mantarıdır. Kandida hücre duvarının ana komponentlerinden birisi olan mannan, mantar-konak ilişkisinde ve mayanın virülansında rol oynamaktadır. C.albicans enfeksiyonlarının gelişiminde, mikroorganizmanın maya formundan hif formuna geçiş yeteneği önem taşır. Hif formu, maya formunda olmayan çeşitli antijenik özelliklere sahiptir ve hif oluştuğunda hücre duvarında yapısal değişiklikler meydana gelir. Bu dönüşüm ile ilgili birçok faktör etkili olsa da, tam olarak yeterli bilgi mevcut değildir. Bu çalışmada, C.albicansın form değiştirdiğinde duvar yapısında yer alan mannanın konfigürasyon değişiminin monoklonal antikorlar kullanılarak araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada C.albicans (NIHA 207) serotip A suşu ile kontrol olarak benzer hücre duvar yapısına sahip Salmonella choleraesuis 211 ve Salmonella infantis suşları kullanılmıştır. C.albicansın maya formu, YEPD agar besiyerinde 28oCde inkübasyon ile, hif formu ise YEPD buyyon besiyerinde çalkalamalı inkübatör üzerinde 37°Cde 3-4 saat inkübasyon ile üretilmiştir. Mannan içeriği, hücrelerin eksponansiyel fazda toplanıp yıkanmasından sonra, pelletin 20 mM sitrat tamponu ile süspanse edilip 125oCde 90 dakika otoklavlanmasıyla elde edilmiştir. Monoklonal antikor üretimi için hibridoma yöntemi kullanılmış; Balb/C farelerinin antijen ile immünize edilmesinden sonra toplanan splenositlerin, F0 myeloma hücreleri ile füzyon oluşturması sağlanmıştır. HAT besiyeri içerisinde oluşan klonlar arasından hibrid hücrelerin ürettiği antikorlar ELISA yöntemi ile izlenmiştir. Antikorların izotip tayini, ticari bir kit (Pierce Biotechnology, ABD) kullanılarak yapılmıştır. Monoklonal antikorları içeren kültür süpernatanları toplanmış ve amonyum sülfat çöktürme yöntemi ile saflaştırılmıştır. Deney reaksiyonlarının tespitinde sandviç ELISA ve immünofloresans (IF) yöntemleri kıllanılmıştır. Çalışmamızda, 2B7 klonu tarafından üretilen ve C.albicans maya hücre duvarına karşı özgüllüğü yüksek olan IgM sınıfından monoklonal antikorlar (mAb-2B7) elde edilmiştir. Bu antikorların, C.albicansa benzer hücre duvar yapı- sına sahip bakterilerden S.choleraesuis 211 ve S.infantis suşları ile çapraz reaksiyon verdiği saptanmıştır. C.albicans maya formunda bulunan mannan β-1,2 bağının varlığı, bu bağlara özgül ticari bir monoklonal antikor (mAb-ACMK-1; Matriks Biotek®, Ankara) kullanılarak doğrulanmıştır. Ayrıca, mAb-ACMK-1in IF yönteminde C.albicansın maya formu ile yüksek floresans verirken hif formu ile ışıma vermeği izlenmiştir. İlk defa elde edilen bu veri, hif duvarında β-1,2 mannan bağlarının ya seyrek olarak bulunduğunu ya da hiç bulunmadığını göstermektedir. Her iki monoklonal antikorun da mannan antijenini tanımasına rağmen, epitop özellikleri farklı olduğundan mAb-2B7 S.choleraesuis 211 ile reaksiyon verirken mAb- ACMK-1 aynı bakteri ile reaksiyon vermemiştir. Sonuç olarak monoklonal antikorlar, kandidaların antijenik yapılarının tanımlanmasına olanak sağlayacak, böylelikle serumda mannan varlığını tespit eden ticari testlerin duyarlılık ve özgüllüğünü artıracak yeni determinantların tespit edilmesi mümkün olabilecektir.