Investigation of Fluoroquinolone Resistance Mechanisms in Clinical Acinetobacter baumannii Isolates

Klinik Acinetobacter baumannii İzolatlarında Florokinolon Direnç Mekanizmalarının Araştırılması

Abstract

Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen which is one of the most important agents of nosocomial infections. Being resistant to many antibiotics, complicates the treatment of the infections caused. Fluoroquinolones are used in the treatment of nosocomial and community-acquired infections and it is important to determine the mechanisms of resistance to these antibiotics. The aims of this study were to investigate ciprofl oxacin (CIP) and levofl oxacin (LEV) minimum inhibitor concentrations (MIC), clonal relationships, mutations that occur in DNA gyrase and topoisomerase IV genes and overexpression of effl ux pumps in nosocomial A.baumannii isolates. A total of 81 A.baumannii strains, 79 CIP-resistant and two CIP-susceptible, isolated from different clinical samples in Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology were included in the study. CIP and LEV MIC values were determined by broth microdilution method. Clonal relationship among the strains was investigated by ERIC-PCR (Enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction). Mutations that occur in gyrA and parC genes were detected by DNA sequence analysis in 16 strains representing each clone and subtype. Overexpression of the effl ux pumps was evaluated by broth microdilution and fl uorometric accumulation experiments were carried out in the presence of pump inhibitors, among the representative strains. MIC50 and MIC90 values for CIP were 256 ?g/ml and >= 256 ?g/ml, while the values were 32 ?g/ml and 128 ?g/ml for LEV, respectively. Overall, CIP MIC values were found to be higher than that of LEV among the A.baumannii strains studied. Isolates were grouped into six main groups and 10 different clusters (39 strains in cluster A, 20 in B, 13 in C, two of each in I and J, one of each in D-H clusters), but it was observed that the majority of them were clonally related. The most common and important mutations detected in the gyrA and parC genes of the representative isolates were, Ser83Leu, Asp87Glu and Ser80Leu, respectively. While the overexpression of effl ux pumps was observed in seven of the representative strains by microdilution method, in 11 by fl uorometric assay and the results were positive in fi ve of the strains by both methods. CIP was found to be better than LEV for detecting the overexpression of pumps by the use of microdilution method. It was concluded that, the reason of high fl uoroquinolone MIC values of the studied nosocomial and clonally related A.baumannii strains were related to target mutations and overexpression of effl ux pumps besides the plasmid-mediated mechanisms, such as Qnr might also have played a role

Özet

Acinetobacter baumannii fırsatçı bir patojen olup, nozokomiyal enfeksiyonların en önemli etkenlerinden biridir. Birçok antibiyotiğe dirençli oluşu, neden olduğu enfeksiyonların tedavisini zorlaştırmaktadır. Florokinolonlar hastane ve toplum kaynaklı birçok enfeksiyonun tedavisinde kullanılan antibiyotikler olup, direnç gelişiminde rol oynayan mekanizmaların belirlenmesi önem taşımaktadır. Bu çalışmada, hastane kaynaklı A.baumannii izolatlarının siprofl oksasin (CIP) ve levofl oksasin (LEV) minimum inhibitör konsantrasyonlarının (MİK) belirlenmesi, klonal ilişkilerinin incelenmesi, fl orokinolonlara direnç gelişiminden sorumlu olan DNA giraz ve topoizomeraz IV enzimlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar ile dışa atım pompalarının aşırı ekspresyonunun araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'nda farklı klinik örneklerden izole edilen CIP'e dirençli 79 ve duyarlı iki izolat olmak üzere toplam 81 A.baumannii kökeni alınmıştır. CIP ve LEV MİK değerleri sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle belirlenmiştir. Kökenlerin klonal yakınlıkları ERIC-PCR (Enterobacterial repetitive intergenic consensus-polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi ile araştırılmıştır. Her farklı klon ve alt tipi temsilen seçilen 16 kökende gyrA ve parC genlerindeki mutasyonlar dizi analizi ile belirlenmiştir. Seçilen kökenlerde dışa atım pompalarının aşırı ekspresyonu, pompa inhibitörleri varlığında gerçekleştirilen sıvı mikrodilüsyon ve fl orometrik akümülasyon deneyleri ile araştırılmıştır. İncelenen A.baumannii kökenlerinde MİK50 ve MİK90 değerlerinin CIP için sırasıyla 256 ?g/ml ve >=256 ?g/ml; LEV için sırasıyla 32 ?g/ml ve 128 ?g/ml olduğu belirlenmiştir. Genel olarak CIP MİK değerlerinin LEV MİK değerlerine göre yüksek olduğu saptanmıştır. İzolatların altı ana grup (I-VI) ve 10 farklı klon (A-J) altında toplandığı saptanmış (A klonunda 39, B'de 20, C'de 13, I ve J'de ikişer, D-H'de ise birer suş); ancak bunların büyük çoğunluğunun klonal olarak ilişkili oldukları gözlenmiştir. Seçilen temsilci kökenlerin gyrA geninde en sık rastlanan önemli mutasyonların Ser83Leu ve Asp87Glu, parC geninde ise Ser80Leu olduğu saptanmıştır. Temsilci kökenlerden yedisinde sadece mikrodilüsyon yöntemiyle, 11'inde sadece fl orometrik olarak aşırı pompa ekspresyonu gözlenirken, beş kökende her iki yöntemle de olumlu sonuç elde edilmiştir. Mikrodilüsyon yöntemiyle aşırı ekspresyonu saptamada CIP'in LEV'den daha iyi olduğu görülmüştür. İncelenen hastane kaynaklı ve klonal olarak ilişkili A.baumannii izolatlarında gözlenen yüksek fl orokinolon MİK değerlerine, hedef bölge mutasyonlarının yanı sıra, dışa atım pompalarının aşırı ekspresyonunun yol açtığı, ayrıca Qnr gibi plazmid kaynaklı mekanizmaların da rol oynayabileceği sonucuna varılmıştır