Production and Molecular Characterization of Plasmodium falciparum Recombinant Circumsporozoite Protein with 37 NANP and 4 NVDP Epitopes

37 NANP ve 4 NVDP Epitoplu Plasmodium falciparum Rekombinant Circumsporozoite Proteinin Ekspresyonu ve Moleküler Karakterizasyonu

Abstract

Malaria is caused by the protozoan parasite Plasmodium, the leading cause of death amongst the parasitic diseases. The disease is transmitted to human by the bites of female Anopheles mosquitoes. According to the World Health Organization (WHO) data, there were an estimated 214 million malaria cases and estimated 438.000 deaths occurred worldwide, in 2015. It is observed that 90% of all the deaths due to malaria occur in Africa. 78% of these cases were children who are under five years old. Intensive malaria interventions helped to reduce malaria incidence by 37% between 2000 and 2015. Malaria is a curable disease if diagnosed and treated promptly and correctly. Drug resistance has developed against almost all anti-malarial drugs and an effective vaccine against malaria has not been developed yet. Vaccine studies initiated 40 years ago by sterile immunity against falciparum malaria through immunization by exposure to 1000 irradiated mosquitoes. Complex structures, complicated life cycles and various antigenic structures of Plasmodium species make vaccination studies difficult. Circumsporozoite protein (CSP), the most extensively studied protein is also present in the content of the vaccine candidate RTS,S which is currently closest to get license. CSP was the first described Plasmodium antigen because of its important role during initiation of the parasitic infection. CSP is the major surface coat protein of Plasmodium parasite. CSP is a soluble protein and recombinant form of the CSP can be produced in Escherichia coli. NANP repeat region is a target site for host antibodies. Recently many DNA, RNA and protein vaccine candidates are being developed against malaria. According to WHO, in the next 20 years period, malaria vaccine can be developed. In this study we aimed to produce recombinant CSP (rCSP). Initially, P.falciparum CSP gene was amplified by PCR. CSP gene was cloned in to the pJET cloning vector. The gene subcloned to the pET100 protein expression vector. E.coli cells were used for protein expression. After this process, purification and endotoxin removal protocols were performed. As a result, 1182 bp CSP gene was obtained from P.falciparum genomic DNA. Accuracy of cloning and DNA sequence of the CSP gene was determined with DNA sequence analysis. The gene sequence was recorded to the GenBank with a registration no KT315396. rCSP was expressed in E.coli cells. The existence of rCSP was verifiedwith Western Blot method and was purified and removed from endotoxins. rCSP aminoacid sequence and 3D shape was obtained.We believe that the production of recombinant CSP will enable us to contribute to the further malaria vaccine studies in our laboratory and country.

Özet

Plasmodium cinsine ait protozoan parazitlerin sebep olduğu sıtma, paraziter hastalıklar arasında en fazla ölüme neden olanıdır. Hastalık dişi Anofel sivrisineğin insanlardan kan emmesiyle bulaşmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre 2015 yılı içerisinde 214 milyon yeni sıtma olgusu görülmüş ve buna bağlı olarak 438 bin ölüm olgusu gerçekleşmiştir. Sıtmaya bağlı ölümlerin %90'ı Afrika kıtasında görülmektedir. Bu ölümlerin %78'i beş yaş altı popülasyonu etkilemektedir. Sıtmaya karşı yürütülen yoğun mücadele sonucunda 2000 ila 2015 yılları arasında hastalığın insidansı %37 azalmıştır. Hızlı ve etkin bir biçimde tanı ve tedavisi gerçekleştirildiğinde, sıtma iyileştirilebilir bir hastalıktır. Halihazırda sıtmaya karşı kullanılan ilaçların hemen hepsine karşı direnç gelişmiş durumdadır ve günümüzde sıtmaya karşı tam etkili bir aşı ise henüz geliştirilememiştir. 40 yıl önce, radyasyon uygulanmış 1000 sivrisineğe maruz bırakılan kişilerde falciparum sıtmasına karşı steril immunite oluşturulmasıyla birlikte çalışmalar başlamıştır. Plasmodium'ların kompleks yapıları ve karmaşık hayat döngüleri ve çok fazla antijenik yapılarının olması aşı çalışmalarını zorlaştırmaktadır. Üzerinde en fazla çalışılan Circumsporozoite protein (CSP), günümüzde lisans almaya en yakın aday olan RTS,S'in de yapısında bulunmaktadır. CSP, enfeksiyonun başlangıcı esnasında oynadığı önemli rolden dolayı parazitin antijenik yapıları içerisinde ilk tanımlananıdır. Plasmodium'ların major yüzey proteinidir. CSP çözünebilir bir proteindir ve Escherichiacoli hücreleri içerisinde bu proteinin rekombinant formu üretilebilmektedir. NANP tekrar bölgesi konak antikorları için hedef özelliğindedir. Günümüzde sıtmaya karşı birçok protein ve DNA aşısı geliştirilmeye çalışılmaktadır. DSÖ'ye göre önümüzdeki 20 yıllık dönemde sıtma aşısının yapılabilmesi mümkündür. Bu çalışmada, P.falciparum CSP'nin rekombinant (rCSP) olarak üretilmesi amaçlanmıştır. Öncelikle CSP geni PCR ile çoğaltılmıştır. CSP geni pJET vektörüne klonlanmış; daha sonra pET100 protein ekspresyon vektörüne subklonlama yapılmıştır. Protein ekspresyonu için E.coli hücreleri kullanılmıştır. Bu işlemden sonra saflaştırma ve endotoksinlerden arındırma protokolleri uygulanmıştır. Sonuç olarak; P.falciparum genomik DNA'sından 1.182 bp'lik CSP geni elde edilmiştir. DNA dizi analizi ile gen klonlamasının doğruluğu ve CSP geninin DNA dizisi tespit edilmiştir. Elde edilen gen dizisi GenBank'a KT315396 kayıt no ile kaydedilmiştir. Plazmit içerisine yerleştirilen CSP geni ile E.coli hücrelerinde rCSP eksprese edilmiştir. Western blot ile varlığı gösterilen rCSP, saflaştırıldıktan sonra endotoksinlerinden arındırılmıştır. rCSP'nin aminoasit dizilimi ve 3 boyutlu şekli elde edilmiştir. CSP'nin rekombinant olarak üretilmesinin laboratuvarımızda ve ülkemizde yapılacak sıtma aşı çalışmalarına katkı sağlayacağı kanaatindeyiz.