Comparison of Polymerase Chain Reaction Using Kinetoplast DNA Specific Primers and Other Parasitological Methods in the Diagnosis of Clinical Samples of Suspected Patients with Cutaneous Leishmaniasis in Şanlıurfa

Şanlıurfa'da Kutanöz Leyşmanyazis Şüpheli Hastalardan Alınan Klinik Örneklerin Tanısında Kinetoplast DNA'sına Özgül Primerlerin Kullanıldığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Diğer Parazitolojik Yöntemlerin Karşılaştırılması

Abstract

Visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL) are seen endemically in Turkey and CL caused by Leishmania tropica is an important public health problem in southeastern as well as other regions of Turkey. The diagnosis has been usually made by clinical view of lesion and/or parasitologically using lesion aspiration smears. Histological examination does not, always reveal the parasite in the skin biopsy, particularly in chronic lesions. Besides this, due to CL infections caused by different species in endemic areas, diagnostic methods enabling species identification are in great need. Species identification, in the time of diagnosis, is an important procedure for helping the clinicians in the planning of treatment as well as control measures. Polymerase chain reaction (PCR) is a specific and sensitive diagnostic tool that can also identify the parasite at species level. Kinetoplast DNA (kDNA) is one of the genetic regions that can be used for the detection of Leishmania parasites in clinical specimens, kDNA PCR is reported as one of the most sensitive methods related to species-specific variable regions in mini-circle long time ago. It has been considered as one of the most ideal targets for the diagnosis of leishmaniasis. The aim of the study was to perform PCR targeting kDNA by using the primers of Uni21/Lmj4 in clinical samples and compare the results with other parasitological methods like smear and culture, for the diagnosis of CL. The kDNA PCR, parasite culture and microscopical evaluation of stained smears of 62 specimens from suspected CL cases who have referred to Cutaneous Leishmaniasis Diagnosis and Treatment Center in Sanliurfa, Turkey were included in the study. The kDNA PCR showed the highest sensitivity 100% of the samples (35/35) among all diagnostic assays, followed by the microscopy (25/35 positive, 71.4% sensitivity) and culture (19/35 positive, 54.3% sensitivity). The sensitivity of combination of culture and microscopy was 88.6% (31/35 positive). These results suggested that performing kDNA PCR in addition to conventional techniques is important for improving the true diagnosis of CL to the species level and also important for establishing treatment regimens and designing appropriate precautions in highly endemic area like the southeastern region of Turkey.

Özet

Visseral leyşmanyazis (VL) ve kutanöz leyşmanyazis (KL) Türkiye'de endemik olarak görülmektedir. Leishmania tropica'nın neden olduğu KL, Güneydoğu Anadolu Bölgesi'nde olduğu gibi Türkiye'nin diğer bölgelerinde de halk sağlığı problemi olarak önem kazanmıştır. Tanı, genellikle lezyonun klinik görünümü ve/veya lezyonun aspirasyon yayma preparatlarının mikroskobik incelemesiyle konulmaktadır. Özellikle kronik lezyonlarda deri biyopsi örneği histolojik olarak incelendiğinde, parazit varlığının her zaman saptanamadığı durumlar olabilmektedir. Bunun yanı sıra, endemik bölgelerde KL enfeksiyonlarının farklı türlerle de oluşması nedeniyle tür tayininin yapıldığı tanı yöntemlerini kullanmak önem arz etmektedir. KL tanısı konurken aynı zamanda türün tanımlanması, klinisyenlere tedavinin planlanmasında yardımcı olduğu gibi hastalığın kontrolünde alınması gerekli önlemlerin belirlenmesinde de önem taşımaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), paraziti tür düzeyinde ayırabilen yüksek derecede özgün ve hassas bir tanı yöntemidir. Kinetoplast DNA'sı (kDNA), klinik örneklerde Leishmania parazitinin saptanmasında kullanılan hedef genetik bölgelerdendir. Farklı gen bölgelerinin hedeflendiği PCR yöntemi leyşmanyazis tanısında uzun süredir kullanılmakta olup kDNA'sının kullanıldığı PCR, parazit DNA'sının küçük daire bölgesinin türlere özgü değişken bölgelerini hedefleyen en duyarlı yöntemler arasında yer almaktadır. Kinetoplast DNA bölgesi, leyşmanyazis tanısında ideal hedeflerden birisi olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmanın amacı, KL tanısı için alınan klinik örneklerde, Uni21/Lmj4 primerleri kullanılarak kinetoplastik DNA'yı hedefleyen PCR yöntemini uygulamak ve elde edilen sonuçları yayma ve kültüre dayalı diğer parazitolojik yöntemlerle karşılaştırmaktır. Çalışmada, Şanlıurfa Şark Çıbanı Tanı ve Tedavi Merkezine başvuran KL şüpheli hastalardan alınan 62 örnek kullanılmıştır. Klinik örnekler kinetoplast DNA'yı hedefleyen PCR, parazit kültürü ve yayma preparatlarının mikroskobik incelenmesi yöntemleriyle çalışılarak sonuçlar değerlendirilmiştir. PCR ile 35 klinik örnekte KL tanısı konulmuş ve bu yöntemin tüm yöntemler arasında en yüksek duyarlılığı (%100) gösterdiği tespit edilmiştir. PCR ile tüm mikroskobik ve/veya kültür pozitif örneklerde de olumlu sonuç alınmıştır. Ayrıca, PCR ile diğer yöntemlerle saptanmayan dört KL olgusu saptanmıştır. Mikroskobik inceleme ile 25 hastada %71.4 duyarlılıkla, kültür yöntemi ile 19 hastada %54.3 duyarlılıkla tanı konulmuştur. Kültür ve mikroskobik inceleme yöntemleri birlikte uygulandığında duyarlılık %88.6 (31/35 olguda pozitiflik) olarak bulunmuştur. Bu sonuçlara göre, özellikle Güneydoğu Anadolu gibi yüksek KL açısından endemik bölgelerde klasik yöntemlerin yanı sıra kDNA PCR'nin uygulanması hem tanıda duyarlılığın yükseltilmesi hem de tür düzeyinde tanımlama yapmaya olanak vermesi, ayrıca buna bağlı olarak uygun tedavi rejimlerinin oluşturulması ve gerekli önlemlerin alınması açısından önem taşımaktadır.