Galleria mellonella Larva Model in Evaluating the Effects of Biofilm in Candida albicans

Candida albicans Biyofilm Etkilerinin Değerlendirilmesinde Galleria mellonella Larvası Modeli

Abstract

Biofilm-related infections are chronic infections that cause serious increase in morbidity and mortality as well as significant economic loss. Galleria mellonella larva is shown as a reliable animal model for in vivo toxicology and pathogenicity tests due to its large size, ease of practice, ability to survive at 15-37°C and its similarity to mammals' natural immune system. The aim of this study was to evaluate the effects biofilm activity of Candida albicans in a G.mellonella larva model. Two C.albicans strains isolated as a disease agent were used for the model, where one was positive (BP), and the other one was negative (BN) for biofilm production. Eighty healthy G.mellonella larvae, all in the last larval stage and 2-2.5 cm long, were divided into 4 groups of equal size. Group 1 was set as the control group. Group 2 was injected with sterile phosphate buffer (PBS) group. Group 3 was injected with BP C.albicans strain and group 4 with BN C.albicans strain. A 5 ?L volume of C.albicans prepared at 5 × 105 cfu/ml concentration with PBS was injected into the last left rear-legs of the larvae. The larvae were kept in sterile petri dishes at 37°C. They were observed for a total of 96 hours, for 4 hours in the first 24 hours, then in 12 hours intervals. Melanization, survival, total hemocyte count and fungal burden were evaluated as infection indicators. Melanization and death were not observed throughout the study period in group 1. One larva died in group 2. Small melanization spots (dark spots) and subsequent progressive melanization were observed from 3rd hour in the larvae infected with C.albicans. When compared with the BN C.albicans infected group, survival rate was 20% for BP C.albicans infected larvae at the end of 24 hours. Total hemocyte count was very low in the infected groups compared to groups 1 and 2, also significantly lower in group 3 than in group 4. In quantitative cultures, growth of C.albicans was detected in groups 3 and 4 while not in groups 1 and 2. Fungal load was significantly higher in BP C.albicans infected group than BN C.albicans infected group. In this study, G.mellonella larvae were used as live hosts to demonstrate the effects of biofilm activity of C.albicans. Our results suggest that larval models can be used to investigate the effects of fungal infections and biofilm like virulence factors on host cells, and invertebrate animal models can be widely used and can bridge between in vitro studies and mammalian models.

Özet

Biyofilm ile ilişkili enfeksiyonlar morbidite ve mortalitede artışlara, ekonomik anlamda ciddi kayıplara neden olan kronik enfeksiyonlardır. Galleria mellonella larvası büyük boyutları, uygulama kolaylığı, 1537°C'de yaşayabilme yeteneği, doğal bağışıklık sisteminin memeliler ile benzer olması gibi, nedenlerle in vivo toksikoloji ve patojenite testleri için güvenilir bir hayvan modeli olarak gösterilmektedir. Bu çalışmada Candida albicans biyofilm aktivitesinin etkilerinin, G.mellonella larvası modelinde değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Model için hastalık etkeni olarak izole edilen, biyofilm üretimi pozitif (BP) ve negatif (BN) olarak saptanan iki C.albicans izolatı kullanıldı. Son larval evrede, 2-2.5 cm uzunluğunda, sağlıklı 80 adet G.mellonella larvası eşit olarak 4 gruba ayrıldı (n= 20). Grup 1 sağlıklı kontrol grubu olarak belirlendi. Grup 2'ye steril fosfat tamponu (PBS), grup 3'e BP C.albicans izolatı ve grup 4'e BN C.albicans izolatı enjekte edildi. PBS ile 5 x 105 cfu/ml yoğunlukta hazırlanan C.albicans'ın 5 ?l'si larvaların en sondaki sol bacaklarına enjekte edildi. Larvalar, steril petri kutuları içinde 37ºC'de bekletildi. İlk 24 saat içinde 4 saat, daha sonra 12 saat ara ile toplam 96 saat süreyle gözlendi. Enfeksiyon göstergesi olarak; melanizasyon, sağkalım, toplam hemosit sayısı ve fungal yük değerlendirildi. Çalışma süresince grup 1'de melanizasyon ve ölüm gözlenmedi. Grup 2'de bir larva kaybedildi. C.albicans ile enfekte larvalarda 3. saatten itibaren küçük melanizasyon odakları (siyah nokta) ve ardından ilerleyici melanizasyon gözlendi. BN C.albicans ile enfekte grup ile karşılaştırıldığında, BP C.albicans ile enfekte larvalarda 24. saat sonunda sağkalım oranı %20 olarak belirlendi. Toplam hemosit sayıları değerlendirildiğinde enfeksiyon gruplarında grup 1 ve 2'ye göre çok düşük bulundu. Grup 3'de ise hemosit sayısı grup 4'e göre anlamlı olarak düşük saptandı. Kantitatif kültürlerde grup 1 ve 2'de mikroorganizma üremesi saptanmadı. Grup 3 ve 4'de C.albicans üremesi saptandı. BP C.albicans ile enfekte grupta, BN C.albicans ile enfekte gruba göre fungal yük anlamlı olarak yüksek saptandı. Bu çalışmada, C.albicans biyofilm aktivitesinin etkilerinin gösterilmesinde canlı konak olarak G.mellonella larvası kullanılmıştır. Sonuçlarımız fungal enfeksiyonların ve biyofilm gibi virülans faktörlerinin konak hücreye etkilerinin araştırılmasında larva modelinin kullanılabileceğini, omurgasız hayvan modellerinin yaygınlaşarak in vitro çalışmalar ile memeli modelleri arasında köprü oluşturabileceğini düşündürmektedir.