Evaluation of the Reproductive Potential of Encephalitozoon intestinalis in Four Different Cell Line

Encephalitozoon intestinalis’in Dört Farklı Hücre Hattında Üreme Potansiyelinin Değerlendirilmesi

Abstract

Microsporidia are parasites that can cause infections in many vertebrate and invertebrate organisms and produce small spores resistant to environmental conditions. As they are obligate intracellular parasites, axenic cultures cannot be performed. The aim of this study was to investigate the reproductive potential of the parasite in human colon epidermal adenocarcinoma (Caco-2), human monocytic (U937), African green monkey renal epithelial (VERO) and human kidney epithelial (HEK-293) cell lines of tissue and organs where the parasite is located by following the culture of the parasites and the amount of spores for six weeks. RPMI-1640 medium was used for the cultivation of U937 cells, while DMEM was used for other cell lines and the immature U937 cells were stimulated with Phorbol-12-Myristate-13-Acetate before infection. All of the host cell groups were infected with freshly collected Encephalitozoon intestinalis spores in ratio 1:30 and free spores in the culture media were removed after overnight incubation at 37°C under 5% CO2 condition for parasite invasion. The first release of the spores from the infected cells was observed and recorded by following for six weeks. Furthermore, the spore density released from each cell groups was evaluated by measuring the parasite load by Thoma cell counting chamber and quantified by real-time PCR. As a result of the study, it was observed that four cell lines could be infected by E.intestinalis and the spore production can be maintained for six weeks. It was observed that the monolayer macrophages and CaCo-2 cells, started to be detached from the culture flasks in few days following the parasite invasion, thus decreasing the number of host cells. After 1-2 weeks, HEK-293 cells were also detached from the surface, thus negatively affected the pure spore production by contaminating the media with dead host cell suspension. Spores started to appear in VERO cell media at the end of the second week after initial infection, while it took longer time for other cells to start releasing spores. Over the course of six weeks, the VERO cell line had the highest spore-producing potential among the other cell lines. In conclusion, this study compared the potential for reproduction of E.intestinalis in three human cell lines and monkey originated VERO cell line. This study demonstrated that cells derived from the tissues or organs where Microsporidia species causes disseminated infections could be infected by the parasitic spores in vitro. Additionally, the parasite can survive and propagate longer than six weeks. The authors believe that the results of this study will contribute to the further studies related to the parasite in the area of genetics, pharmacology, biochemistry, immunology and eradication studies.

Özet

Microsporidia, omurgalı ve omurgasız birçok canlıda enfeksiyon oluşturan, küçük ve dış ortam koşullarına dirençli sporlara sahip parazitlerdir. Zorunlu hücre içi parazitleri oldukları için aksenik kültürleri yapılamamaktadır. Bu çalışmada, insan kolon epidermal adenokarsinoma hücresi (Caco-2), insan monositik hücreleri (U937), Afrika yeşil maymunu böbrek epitel hücre hattı (VERO) ve insan böbrek epitel hücreleri (HEK-293) olmak üzere parazitin yerleştiği doku ve organlara ait hücre hatlarında parazit kültürünün yapılması ve altı hafta boyunca spor miktarı takip edilerek bu hücre hatlarında parazitin üreme potansiyelinin araştırılması amaçlanmıştır. U937 hücrelerinin üretilmesi için RPMI-1640 besiyeri, diğer hücre hatları içinse DMEM kullanılmıştır. U937 hücreleri, Phorbol-12-Myristate-13-Asetate ile stimülasyon sağlandıktan sonra enfekte edilmiştir. Parazit invazyonunun gerçekleşebilmesi için 37°C’de %5 CO2’li ortamda bir gece inkübe edildikten sonra besiyeri içerisindeki serbest halde bulunan sporlar uzaklaştırılmıştır. Altı hafta boyunca tüm kültürler takip edilerek sporların konak hücrelerinden ilk çıkış süresi, enfeksiyon sonrası konak hücrelerinin durumu gözlenmiştir. Enfekte hücrelerden açığa çıkan spor yoğunluğu; kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRt-PCR) ile parazit yükü hesaplanarak ve Thoma lamı ile sayılarak farklı hücrelerde parazitin üreme potansiyelleri değerlendirilmiştir. Çalışma sonunda dört hücre hattının da enfekte edilebildiği ve en az altı hafta boyunca enfeksiyonun devam ettiği gözlenmiştir. Enfeksiyon sonrası birkaç günlük süreçte yüzeye tutunmuş haldeki makrofaj ve CaCo-2 hücrelerinin yüzeyden ayrılmaya başladığı ve böylece hücre sayısının da azaldığı gözlenmiştir. Daha sonraki günlerde HEK-293 hücrelerinin de yüzeyden ayrılarak kirli besiyerinin oluşmasına ve dolayısıyla da saf spor elde edilmesinin olumsuz yönde etkilenmesine sebep olduğu saptanmıştır. VERO hücrelerinde ikinci haftanın sonunda sporların çıkmaya başladığı görülmüş olup, diğer hücrelerde spor çıkmaya başlaması daha uzun sürmüştür. Altı hafta boyunca VERO hücrelerinde parazitin üreme potansiyelinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Bu çalışmada insan orijinli üç hücre hattı ile maymun orijinli VERO hücre hattında E.intestinalis üreme potansiyeli karşılaştırılmıştır. Bu çalışma, yaygın enfeksiyonlara sebep olan E.intestinalis’in yerleştiği doku ve organlara ait hücreleri enfekte edebildiğini ve enfeksiyonun altı hafta boyunca devam ettiğini göstermiştir. Bu çalışmada elde edilen sonuçların; parazitle ilişkili genetik, farmakolojik, biyokimyasal, immünolojik alanda yapılacak olan çalışmalara katkı sağlayacağı düşünülmektedir.