Isolation of Rickettsia slovaca by Shell-Vial Cell Culture Method from Dermacentor marginatus Ticks

Shell-Vial Hücre Kültürü Yöntemi ile Dermacentor marginatus Türü Kenelerden Rickettsia slovaca İzolasyonu

Abstract

Rickettsia species are gram negative, small pleomorphic coccobacilli, obligate intracellular bacteria. The majority of these bacteria are transported by the ticks. Rickettsia slovaca and Rickettsia raoultii are among the Rickettsia species in the spotted fever group and carried by Dermacentor species ticks, that cause tick-borne lymphadenopathy (Tickborne Lymphadenopathy-TIBOLA or Dermacentor-borne necrotic erythema and lymphadenopathy- DEBONEL). Rickettsia species are obligate intracellular bacteria and they can be cultivated in cell cultures. The chance of isolation of Rickettsia species from clinical and tick specimens has been increased by the shell-vial centrifugation cell culture method. The aim of this study was to isolate R.slovaca from two Dermacentor marginatus species ticks which were detected in humans by the use of shell-vial centrifugation cell culture method using VERO cell. Before proceeding to the culture stage, an algorithm including description, disinfection, dissection of ticks and methods of hemolymph, homogenization, DNA extraction and real-time PCR was performed. Iodine-alcohol disinfection was performed following identification of the ticks with the use of a stereo microscope. Ticks hemolymph were obtained with extremity dissection of ticks and indirect fluorescence antibody (IFA) test was performed with Rickettsia positive sera. Ticks identified as containing Rickettsia like bacteria in hemolymph were homogenized and DNA extraction was performed from homogenate of ticks. By real-time PCR, using Rickettsia genus-specific PanR8 primers and probes, PCR positive Rickettsia spp. were determined among the ticks. Vero cells that have formed monolayer in vials were used for Rickettsia culture. Homogenized tick samples which were positive for Rickettsia in hemolymph and real-time PCR methods were inoculated to cell culture vials. Suspended bacteria in the inoculum were allowed to approach the cells by the shell-vial centrifugation method. Cells were scraped after five days of incubation in 5% CO2 at 36°C. An aliquot of the determined cell suspension was fixed to the slides and then IFA was performed using Rickettsia positive sera. In fluorescence microscopy examination, adhered and proliferated bacteria were observed on Vero cells. This cell suspension was again inoculated into the Vero cell cultures to increase bacterial replication and taken for 5-7 days of incubation. DNA was extracted from the suspension of the cultivated bacteria. Conventional PCR of citrate synthase (gltA) and outer membrane protein A (ompA) gene regions were used to identify Rickettsia species. DNA sequence analysis of PCR amplification products were determined. DNA sequence results were compared to Genbank data and found that the gltA sequence was 100%, similar to R.slovaca with accession number AY129301.1 and the ompA sequence was 100%, similar to R.slovaca with accession number KF791242.1. In addition, the two strains isolated in phylogenetic analysis were found to be R.slovaca. As a result, R.slovaca isolation from of D.marginatus type ticks has been reported for the first time in our country by the cell culture method.

Özet

Rickettsia türleri, gram negatif, küçük pleomorfik kokobasil şeklinde, zorunlu hücre içi yerleşim gösteren bakterilerdir. Bu bakterilerin çoğunluğu keneler tarafından taşınır. Dermacentor cinsi kenelerin taşıdığı, benekli ateş grubu içindeki Rickettsia türlerinden Rickettsia slovaca ve Rickettsia raoultii, kene kaynaklı lenfadenopatiye (Tickborne Lymphadenopathy-TIBOLA veya Dermacentor-borne necrotic erythema and lymphadenopathy- DEBONEL) neden olmaktadır. Rickettsia türleri zorunlu hücre içi bakteriler olduğu için hücre kültürlerinde üretilebilirler. Shell-vial santrifügasyon hücre kültürü yöntemi ile hem klinik hem de kene örneklerinden Rickettsia türlerinin izolasyon şansı artırılmıştır. Bu çalışmada, insanlarda saptanan iki adet Dermacentor marginatus türü keneden, VERO hücresi kullanılarak shell-vial santrifügasyon hücre kültürü yöntemi ile R.slovaca izolasyonun yapılması amaçlanmıştır. Kültür aşamasına geçmeden önce kenelerin tiplendirilmesi, dezenfeksiyonu, diseksiyonu, hemolenf testi, homojenizasyonu, DNA ekstraksiyonu ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) yöntemlerini içeren bir algoritma izlenmiştir. Stereo mikroskopta kenelerin tiplendirilmesinin takibinde iyodin-alkol dezenfeksiyonu yapılmıştır. Ekstremite diseksiyonu ile kenelerin hemolenfleri elde edilmiş ve Rickettsia pozitif serumla indirekt floresan antikor testi (IFAT) uygulanmıştır. Hemolenf içinde Rickettsia benzeri bakterileri içerdiği belirlenen keneler homojenize edilmiş ve bir bölümünden DNA ekstraksiyonu yapılmıştır. Rickettsia cins spesifik PanR8 primer ve probları kullanılarak Rt-PCR ile kenelerde Rickettsia spp. PCR pozitifliği saptanmıştır. Rickettsia kültürü için Vero hücreleri kullanılarak shell-vial içine pasajlanan Vero hücrelerinin monolayer oluşturması beklenmiştir. Rickettsia yönünden hemolenf ve Rt-PCR pozitif homojenize kene örneklerinden Vero hücre kültürlerine inokülasyon yapılmış ve shell-vial santrifügasyon yöntemi ile inokülum içinde süspanse olan bakterilerin hücrelere yaklaştırılmaları sağlanmıştır. Hücreler, 36oC’de %5 CO2’li etüvde beş günlük inkübasyondan sonra kazınarak kaldırılmıştır. Elde edilen hücre süspansiyonundan bir miktar lamlara fikse edildikten sonra Rickettsia pozitif serum kullanılarak IFAT çalışılmıştır. Floresan mikroskopta Vero hücreleri içinde floresan veren bakteriler gözlenmiştir. Bu hücre süspansiyonu, bakteri üremesini artırmak amacıyla tekrar Vero hücre kültürüne inoküle edilerek 5-7 gün inkübe edilmiştir. Üretilen bakteri süspansiyonundan DNA ekstraksiyonu yapılarak Rickettsia türlerinin tanımlanmasında kullanılan sitrat sentez (gltA) ve dış membran protein A (ompA) gen bölgeleri konvansiyonel PCR yöntemi uygulanarak gösterilmiştir. PCR amplifikasyon ürünlerinin DNA dizi analizi yapılmıştır. DNA dizi analiz sonuçları Genbank verileri ile karşılaştırıldığında gltA dizi analizi accesion number AY129301.1 R.slovaca ile OmpA dizi analizi, accesion number KF791242.1 R.slovaca ile %100 benzer bulunmuştur. Ayrıca, filogenetik analizlerde izole edilen iki suşun da R.slovaca olduğu ortaya konulmuştur. Bu çalışma sonucunda, ülkemizde ilk defa D.marginatus türü kenelerden hücre kültürü yöntemi ile R.slovaca izolasyonu bildirilmiştir.