Method Verification of Inhouse Real-time Polymerase Chain Reaction for Detection of Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii’nin Inhouse Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saptanmasında Yöntemin Doğrulanması

Abstract

Toxoplasmosis is one of the most common parasitic infection in humans. Serological and molecular methods are used for diagnosis. Molecular methods are becoming increasingly preferred, since they lead to shortening of diagnostic time. In our study, it was aimed to determine Toxoplasma gondii by a cost-effective, quantitative, fast and reliable method without using a commercial kit, and apply method verification. T.gondii strain which was continued by mouse inoculation in our laboratory was used for method verification study. For this purpose DNA extraction was performed using a commercial kit. The limit of detection and, high and low positivity rates were determined by serial dilutions of DNA sample. Accuracy and certainty studies were performed using with TG-F, TG-R primers and TaqMan TG probe for method verification of the test. In the study with serial dilutions of DNA sample, detection limit was determined as 10-3 dilutions (0.028 copies/reaction). Furthermore 10-1 dilution (2.8 copies/reaction) was considered as high positive, 10-2 dilution (0.28 copies/reaction) was considered as low positive and method verification studies were performed. The accuracy of test was determined as 0.62 for high positive samples and 0.14 for low positive samples. CV value of intra-assay certainty was 0.62 for high positive samples and 0.14 for low positive samples, whereas, CV value of inter-assay certainty was calculated as 1.03 for high positive samples and 2.34 for low positive samples. Correlation coefficient was determined as 0.99. The coefficient of variation of inhouse realtime PCR method used in our study was found to be below 15%, and it was decided to be suitable for routine laboratory studies.

Özet

Toksoplazmozis tüm dünyada insanlarda en sık görülen paraziter enfeksiyonlardan biridir. Özellikle immün sistemi sağlam konaklarda asemptomatik ve kendini sınırlayan bir enfeksiyon şeklinde görülmektedir. Bununla birlikte gebelerde ve immün sistemi baskılanmış hastalarda ciddi komplikasyonlara neden olabilmektedir. Tanısında serolojik ve moleküler yöntemler kullanılmaktadır. Birçok hastalıkta olduğu gibi, moleküler yöntemler özellikle tanı konulma süresinin kısalmasını sağladığı için daha çok tercih edilmektedir. Çalışmamızda Toxoplasma gondii’nin ticari kit kullanılmadan düşük maliyetli, kantitatif sonuç verebilen, hızlı ve güvenilir bir moleküler yöntemle belirlenmesi ve ayrıca yöntemin doğrulanmasından sonra rutin hasta örneklerine uygulanması amaçlanmıştır. Laboratuvarımızda fare pasajı ile sürdürülmekte olan T.gondii suşundan (14.000 takizoit/ml), ticari bir DNA ekstraksiyon kiti ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda DNA ekstraksiyonu yapılmıştır. Elde edilen DNA örneğinden (14.000 genomik DNA/ml) hazırlanan seri dilüsyonlarla inhouse gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) yöntemi ile saptama sınır değeri ve buna göre yüksek ve düşük pozitiflik oranları belirlenmiştir. Testin doğrulanması için doğruluk ve kesinlik çalışmaları TG-F, TG-R primerleri ve TaqMan TG prob kullanılarak Lightcycler 96 realtime PCR cihazı (ThermoFisher Scientific, ABD)’nda gerçekleştirilmiştir. DNA ekstraksiyonu sonucu elde edilen DNA örneğinin seri dilüsyonlarıyla yapılan çalışma sonucunda testin saptama sınır değeri 10-3 dilüsyon (0.028 kopya/reaksiyon) olarak belirlenmiştir. Yüksek pozitif olarak 10-1 dilüsyon (2.8 kopya/reaksiyon), düşük pozitif olarak 10-2 dilüsyon (0.28 kopya/reaksiyon) kabul edilerek yöntemin doğrulanması amacıyla çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Testin doğruluk çalışması CV değeri yüksek pozitif örnek için 0.62, düşük pozitif örnek için 0.14 olarak belirlenmiştir. Çalışma içi kesinlik çalışması CV değeri yüksek pozitif örnek için 0.62, düşük pozitif örnek için 0.14 olarak belirlenirken, çalışmalar arası kesinlik çalışması CV değeri yüksek pozitif örnek için 1.03, düşük pozitif örnek için 2.34 olarak hesaplanmıştır. Çalışma sonucunda korelasyon katsayısı 0.99 olarak belirlenmiştir. Toksoplazmozisin moleküler yöntemlerle tanısında kullanılan ticari yöntemlerin uygulanması kolay olmasına rağmen, maliyetlerinin yüksek olması nedeniyle birçok laboratuvar tarafından alternatif yöntemler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Çalışmamızda kullanılan inhouse Rt- PCR yönteminin varyasyon katsayısının %15’in altında olduğu belirlenmiştir ve testin rutin laboratuvar çalışmalarına uygun olduğuna karar verilmiştir.