Alternative Approaches in Direct Microscobic Examination of Fresh Fecal Samples

Taze Dışkı Örneklerinde Direkt Mikroskobik İncelemede Alternatif Yaklaşımlar

Abstract

Aim of the present study was to identify protozoones which are difficult to define through wet slide in fresh fecal samples by using different fixatives with modified Trichrome stain within five minutes. Two different fixatives prepared for the alternative approach. The slides were fixed by two different fixatives, one of them (fixative-1) was based ethylalcohol, formalin, acetic acid, distilled water and the other one (fixative-2) based ethylalcohol, formalin, citric acid, distilled water included a mordant [divalent or polyvalent metals which make coordination complex with some dyes] consisted copper sulphate pentahydrate (CuSO4 .5H2 O). Slides prepared by the two different fixatives were stained by a different modification of Gomori’s trichrome stain that we made. Samples fixed by Schaudinn fixative including mercury chloride were stained by Wheatley modification of Gomori’s trichrome stain as a gold standard for control and comparison. We worked with 50 fecal samples which we thought included human intestinal protozoones after the wet slide examination. Comparing the methods, slides prepared with the method including citric acid gave almost similar results with the classical method excluded Entamoeba coli cystes. Slides prepared with the methode including acetic acid gave low performance compared with the classical method especially E.coli cystes and Blastocystis spp., Endolimax nana, Iodamoeba bütschlii, E.hartmanni. Both new fixatives gave superior performance at the slides included Dientamoeba fragilis and approximately shorten the procedure process ten times than the classical method. When the both alternative methods compared in each other, the slides prepared with fixative-2 exposed better performance for the protozoones Blastocystis spp., E.nana, I.bütschlii and E.hartmanni while the fixative-1 displayed minimal superiority for D.fragilis including criterias that we based. The fixative-2 and modified stain methode that we used in our study, makes available the diagnostic phase ten times faster than the classical method in human stool parasitological tests excluding the E.coli cystes at parasitology and microbiolgy laboratories. It seems to be a good option to the classical method for routine usage.

Özet

Bu çalışmada, taze dışkı örneklerinde, ıslak preparat (nativ-lugol) incelemesinde tanımlamada zorlandığımız protozoonların farklı fiksatifler kullanılarak modifiye edilmiş trikrom boyası ile yaklaşık beş dakika içinde tanımlanması amaçlanmıştır. Alternatif yaklaşımda kullanılmak üzere iki farklı fiksatif hazırlanmıştır. Mordan [bazı boyalar ile koordinasyon kompleksleri oluşturan polivalan (en az +2 değerlikli) metaller] olarak bakır sülfat pentahidrat (CuSO4 .5H2 O) kullanılarak hazırlanmış olan fiksatiflerden bir tanesi (fiksatif-1) etil alkol, formalin, asetik asit, distile su bazlı olup, diğeri (fiksatif-2) ise etil alkol, formalin, sitrik asit, distile su bazlı olarak hazırlanmıştır. İki ayrı fiksatif ile de tespit edilmiş preparatlar Gomori’nin trikrom boyasının tarafımızca modifiye edilmiş şekli ile boyanmıştır. Kontrol ve kıyaslama amacıyla altın standart olarak; cıva klorür içeren Schaudinn fiksatifi ile fikse edilen örnekler Gomori’nin trikrom boyasının Wheatley modifikasyonu ile boyanmıştır. Taze dışkı örneklerinde nativ-lugol inceleme yapıldıktan sonra, insan bağırsak protozoonu içerdiği düşünülen 50 adet dışkı örneği üzerinde çalışılmıştır. Yöntemler kıyaslandığında, sitrik asit içeren yöntem ile hazırlanan preparatlar (Entamoeba coli kistleri içerenler dışında) klasik yöntem kullanılarak hazırlanan preparatlara hemen hemen yakın sonuçlar verirken, asetik asit içeren yöntem ile hazırlanan preparatlar klasik yönteme göre Entamoeba coli kistleri içerenlerde çok net olmak üzere Blastocystis spp., Endolimax nana, Iodamoeba bütschlii ve Entamoeba hartmanni içeren preparatlarda daha düşük bir performans sergilemiştir. Klasik yönteme kıyasla her iki yeni fiksatifte Dientamoeba fragilis içeren preparatlarda daha üstün bir performans sergilerken, süreç açısından da yaklaşık on katlık bir zaman avantajı sağlamıştır. Her iki alternatif yöntem kendi aralarında kıyaslandığında ise, fiksatif-2 ile hazırlanan preparatlar Blastocystis spp., E.nana, I.bütschlii ve E.hartmanni açısından kıstas alınan kriterler bazında daha iyi performans sergilerken, fiksatif-1 D.fragilis içeren preparatlarda minimal bir üstünlük sergilemiştir. Çalışmamızda kullanmış olduğumuz fiksatif-2 ve modifiye edilmiş boyama yöntemi parazitoloji ve mikrobiyoloji laboratuvarlarında yapılmakta olan insan dışkısına ait parazitolojik tetkiklerde boya ile tanımlama sürecinde E.coli kistleri içerenler dışında klasik yönteme kıyasla on kat daha hızlı tanıya ulaşılmasına olanak sağlamaktadır. Bu yöntemin rutin mikrobiyolojik tanıda klasik yönteme iyi bir alternatif olabileceği düşünülmüştür.