Silencing the Target Rhoptry Neck Protein (RON) Gene Responsible For the Invasion of Toxoplasma gondii with siRNA Transfection

Toxoplasma gondii’nin İnvazyonundan Sorumlu Hedef Rhoptry Neck Protein (RON) Geninin siRNA Transfeksiyonu ile Susturulması

Abstract

Toxoplasma gondii is a coccidian protozoan that causes toxoplasmosis is a common disease in Turkey as well as all over the world. It causes various clinical symptoms depending on the immune system status, age, or location of the disease. There is an organelle called the apical complex at the anterior end of the parasite. Rhoptry Neck Proteins (RONs), a component of this organelle, play a critical role in the formation of “moving junction” and parasitophorous vacuoles during host cell invasion. On the other hand, interfering RNA (iRNA) treatment options developed in recent years have emerged. With small iRNAs (siRNA) it is also possible to treat and control parasitic diseases, too. From here it is thought to use this method against toxoplasmosis. Within the scope of the project, it is aimed to silence RON1 gene the target invasion molecules of T.gondii with siRNA transfection. In the study, the negative control group constitute HeLa cells, the positive control group constitute HeLa cells infected with T.gondii tachyzoites and the experimental group constitute HeLa cells infected with T.gondii tachyzoites after siRNA transfection were used. Samples were collected in each study group at 30 seconds, 1 minute, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 36 hours and 48 hours. In order to calculate the proportional change of the parasite loads between control groups and experimental groups, RNA and protein isolations were performed from these samples for real time polymerase chain reaction (qRt-PCR) and WB analyzes, respectively. The statistical difference between control groups and experimental groups was calculated. Significant difference in gene expression in experiments with siRNA1 (p< 0.0055), siRNA2 (p< 0.0003), siRNA3 (p<0.0001), siRNA4 (p< 0.0001), siRNA5 (p< 0.0001), siRNA6 (p< 0.0001), siRNA7 (p< 0.0182), siRNA9 (p< 0.0011) and siRNA10 (p< 0.0004) but there was no significant difference statistically in the experiment with siRNA8 (p< 0.4049) was detected. Thus, it has been detected that invasion was inhibited due to the lack of production of parasite antigen in the cell lysate belongs to experimental groups at WB assays with anti-T.gondii RON1 and total anti-T.gondii antibodies resulting in silencing of the RON1 gene. The suppression of the TgRON1 gene expression by this method is a promising step in the development of anti-toxoplasmosis vaccines and therapeutic agents.

Özet

Koksidiyan bir protozoon olan Toxoplasma gondii’nin sebep olduğu toksoplazmozis tüm dünyada olduğu gibi Türkiye’de de yaygın bir hastalıktır. İmmün sistemin durumuna, yaşa veya yerleştiği bölgeye göre çok farklı klinik belirtilere sebep olmaktadır. Parazitin ön ucunda apikal kompleks adı verilen organel bulunmaktadır. Bu organelin bir bileşeni olan “rhoptry neck protein (RON)”leri konak hücreye invazyon sürecinde “moving junction” formasyonunda ve parazitoforik vakuolün oluşumunda kritik bir role sahiptir. Öte yandan son yıllarda geliştirilen interferens RNA (iRNA) teknikleri ile yeni tedavi seçenekleri ortaya çıkmıştır. Small iRNA (siRNA) ile paraziter hastalıkların tedavisi ve kontrolünün yapılabilmesi de mümkün görülmektedir. Buradan hareketle toksoplazmozise karşı bu yöntemin kullanılması düşünülmüştür. Çalışma kapsamında, T.gondii’nin invazyon molekülü olan RON1 geninin siRNA transfeksiyonu ile susturulması amaçlanmıştır. Çalışmada, negatif kontrol grubunu oluşturan HeLa hücreleri, pozitif kontrol grubunu oluşturan T.gondii takizoitleri ile enfekte HeLa hücreleri ve deney grubunu oluşturan siRNA transfeksiyonu yapıldıktan sonra T.gondii takizoitleri ile enfekte edilen HeLa hücreleri kullanılmıştır. Her çalışma grubundan 30. saniye, 1. dakika, 5. dakika, 15. dakika, 30. dakika, 1. saat, 6. saat, 12. saat, 24. saat, 36. saat ve 48. saat sürelerinde örnekler toplanmıştır. Deney içi kontrol grupları ile deney grupları arasındaki parazit yüklerinin orantısal değişimini hesaplamak üzere, bu örneklerden RNA izolasyonu yapılarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRt-PCR) ve protein izolasyonu yapılarak Western Blot (WB) analizleri gerçekleştirilmiştir. Kontrol grupları ile deney grupları arasındaki istatistiksel fark hesaplanmıştır. siRNA1 (p< 0.0055), siRNA2 (p< 0.0003), siRNA3 (p< 0.0001), siRNA4 (p< 0.0001), siRNA5 (p< 0.0001), siRNA6 (p< 0.0001), siRNA7 (p< 0.0182), siRNA9 (p< 0.0011) ve siRNA10 (p< 0.0004) ile yapılan deneylerde gen ifadesinde anlamlı fark olduğu fakat siRNA8 (p< 0.4049) ile yapılan deneyde istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı tespit edilmiştir. RON1 geninin susturulması sonucu total anti-T.gondii ve anti-T.gondii RON1 antikorları ile yapılan WB analizlerinde, deney grubuna ait hücre lizatlarında parazit antijeninin üretilmemesine bağlı olarak invazyonun engellendiği tespit edilmiştir. Anti-toksoplasmozis aşıların ve terapötik ajanların geliştirilmesi için TgRON1 gen ifadesinin bu yöntem ile baskılanması umut verici bir basamak niteliğindedir.