Comparison of Antiviral Effect of Olive Leaf Extract and Propolis with Acyclovir on Herpes Simplex Virus Type 1

Zeytin Yaprağı Ekstresi ve Propolisin Herpes Simpleks Virüsü Tip 1 Üzerine Antiviral Etkisinin Asiklovir ile Karşılaştırılması

MUSTAFA ALTINDİŞ,Ferhat Gürkan ASLAN,Hüseyin UZUNER,Havva ÜNAL,Mehmet KÖROĞLU,Sedat KULAÇ,Aynur KARADENİZL

Abstract

While acyclovir, a nucleoside analogue, is widely used for herpes simplex virus type 1 (HSV-1), emergence of drug-resistant viruses due to frequent usage of this class of medicines, and their toxic side effects require exploring novel active molecules. Despite the studies on developing synthetic molecules in medical sciences and pharmacology, herbs as a natural source of biologically-active compounds remain popular. In this in vitro study, olive leaf extract (OLE) and propolis alone or in combination with acyclovir were investigated for their antiviral efficacy in HSV-1.Toxic doses of OLE, propolis, and dimethyl sulfoxide, propolis diluent, for Hep-2 (ATCC, CCL-23) cells were determined by conventional cell culture. Using “endpoint” method, the viral dose infecting half of the cell culture (TCID50) was calculated, and viral quantity was determined with Spearman-Karber method. Antiviral effects of OLE and propolis on HSV-1 were investigated by conventional cell culture and real-time cell analysis (RTCA). Combinations of the two extracts with one another and with acyclovir were evaluated by RTCA. Active substances prepared at three different dilutions were added to tubes with HSV-1 of logTCID50: 11.5 in descending order starting from the highest non-toxic concentration, and they were left at room temperature for two different durations (one hour and three hours). The aliquots taken from the tubes were cultured in plates containing Hep-2 cells and evaluated after 72 hours. Combinations of extracts and acyclovir at concentrations at least four times lower than the lowest concentration showing antiviral efficacy against HSV-1 were cultured with Hep-2 cells in the e-plates of the xCELLigence RTCA device, measurements were obtained at 30 minute intervals, and data were recorded in real time. In the test with two different durations and at different concentrations of OLE and propolis, antiviral efficacy was observed both with one-hour and three-hour incubation at a concentration of 10 μg/ml for propolis and 1.2 mg/ml for OLE with RTCA. The duration and concentration of the greatest decrease in viral quantity were in the first one hour and 10 μg/ml for propolis, and in the first one hour and 1.2 mg/ml for OLE. Combination of propolis and OLE with acyclovir caused no cytopathic effects, and the combination of extracts led to delayed cytopathic effect. According to these results, propolis and OLE, alone and in combinations with acyclovir, have antiviral efficacy against HSV-1. These agents may reduce the dose and side effects of acyclovir in case of co-administration since they exert their effects through a different mechanism than acyclovir,possibly through direct virucidal activity, inhibition of virus internalization or viral inhibition in early stages of replication (inhibition of adsorption/binding of viral particles to the cell). These extracts that do not require conversion to active form have the potential to reduce infectivity in oral lesions, prevent spread, and be used in the topical treatment of acyclovir-resistant HSV infections, particularly in immunocompromised patients. However, in vivo studies should be conducted to determine their medicinal properties and potential toxicities. These results should be supported by further comprehensive studies and the efficacy against other viruses should also be investigated.

Özet

Herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1) tedavisinde; bir nükleoz(t)it analoğu olan asiklovir kullanılmakla birlikte, bu tür ilaçların sık kullanımı sonucunda, son dönemde ilaca dirençli virüslerin ortaya çıkması ve bu ilaçların toksik yan etkileri, tedavide yeni aktif moleküllerin araştırılmasına olan ihtiyacı artırmıştır. Tıp bilimleri ve farmakolojideki sentetik molekül geliştirme çalışmalarına rağmen, biyolojik olarak aktif bileşiklerin doğal bir kaynağı olan bitkiler, tüm dünyada popüler olmaya devam etmektedir. Bu in vitro çalışmada, zeytin yaprağı ekstresi ve propolisin tek başına ya da asiklovir ile kombine olarak HSV-1’e karşı antiviral etkinliklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Zeytin yaprağı ekstresi ve propolis ile propolisin çözücüsü olarak dimetilsülfoksitin, Hep-2 (ATCC, CCL-23) hücrelerine toksik dozları konvansiyonel hücre kültürü yöntemi ile belirlenmiştir. “Son nokta” yöntemi kullanılarak doku kültürünün yarısını enfekte eden viral doz (TCID50) değeri hesaplanmış, virüs miktarları Spearman-Karber yöntemine göre belirlenmiştir.Zeytin yaprağı ekstresi ve propolisin, HSV-1 üzerine antiviral etkileri, konvansiyonel hücre kültürü ve gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) yöntemleriyle araştırılmıştır. Her iki ekstraktın asiklovir ve birbirleriyle kombinasyonları ise RTCA ile değerlendirilmiştir. Bu amaçla, logTCID50: 11.5 olan HSV-1 bulunan tüplere,en yüksek nontoksik konsantrasyonlarından başlanarak azalan oranlarda üç farklı dilüsyonda hazırlanan etken maddeler ilave edilmiş ve antiviral etkinliklerinin ortaya çıkması için, iki farklı zaman aralığında (bir saat ve üç saat) oda sıcaklığında bekletilmişlerdir. Bu süreler sonrasında tüplerden alınan sıvılar Hep-2 hücreleri içeren plaklara ekilerek 72 saat sonrasında değerlendirilmiştir. Ekstraktların ve asiklovirin, HSV-1 üzerine antiviral etkinliklerinin olduğu en düşük konsantrasyondan en az dört kat daha düşük konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan ikili kombinasyonları, xCELLigence RTCA cihazına ait e-plaklardaki Hep-2 hücrelerine ekilerek 30 dakika aralıklarla ölçümler yapılmış, veriler gerçek zamanlı olarak kaydedilmiştir. Zeytin yaprağı ekstresi ve propolisin farklı konsantrasyonlarında ve iki farklı zaman periyodu için yapılan değerlendirmede; RTCA yöntemi ile propolisin 10 μg/ml konsantrasyonunda, zeytin yaprağı ekstresinin ise 1.2 mg/ml konsantrasyonunda, hem bir saat hem de üç saatlik inkübasyonda antiviral etkinlik gösterdiği tespit edilmiştir. Virüs miktarındaki en fazla azalmanın olduğu konsantrasyon ve sürenin ise propolis için 10 μg/ml dozunda ilk bir saat içerisinde; zeytin yaprağı ekstresi için 1.2 mg/ml konsantrasyonda ve ilk bir saat içerisinde olduğu tespit edilmiştir. Propolis ve zeytin yaprağı ekstresinin her ikisinin de asiklovir ile olan kombinasyonlarında sitopatik etki gelişmediği, ekstraktların birlikteliğinde ise sitopatik etkinin geciktiği belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, propolis ve zeytin yaprağı ekstrelerinin hem tek başlarına hem de asiklovir ile hazırlanan kombinasyonlarında HSV-1 için antiviral etkinliklerinin olduğu görülmektedir. Asiklovirden farklı bir mekanizma ile olasılıkla doğrudan virüsidal aktivite, virüsün hücre içine girişinin önlenmesi veya replikasyonun erken aşamalarında viral inhibitör (viral partiküllerin hücreye bağlanması ve adsorbsiyonunun önlenmesi) şeklinde etkili olmalarının, birlikte kullanılmaları halinde asiklovir dozunda ve yan etkilerinde azalma sağlayabileceği düşünülmektedir. Aktif forma dönüştürülmeleri gerekmeyen bu ekstraktlar, oral lezyonlarda enfektivitenin azaltılmasında, yayılımın önlenmesinde ve özellikle immün yetmezliği olan hastalarda asiklovire dirençli HSV enfeksiyonlarının topikal tedavisinde kullanılabilme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, tıbbi özelliklerini ve olası toksisitelerini belirlemek için in vivo çalışmalara gereksinim bulunmaktadır. Bu bulgular, ileride yapılacak geniş ve kapsamlı çalışmalarla desteklenmeli ve diğer virüslere karşı etkinlikleri de araştırılmalıdır.