Kutanöz Layşmanyazise Neden Olan Olan Leishmania Türlerinin Sybr Green Bazlı ITS-1 Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yöntemiyle Tiplendirilmesi

Typing of Leishmania Species Causing Cutaneous Leishmaniasisby Sybr Green Based ITS-1 Real Time Polymerase ChainReaction Method

Özet

Kutanöz layşmanyazis (KL) Türkiye’de en sık Şanlıurfa’da görülen önemli bir halk sağlığı sorunudur. İlimizde olduğu gibi, enfeksiyonun farklı Leishmania türleriyle oluştuğu bölgelerde tür tayini yapılması önemlidir. Çalışmamızda Şanlıurfa’dan alınan Leishmania şüpheli 136 örneğin, Sybr Green bazlı ITS-1 gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) yöntemi kullanılarak tiplendirilmesi ve daha sonra ITS-1 PCR RFLP ve direkt mikroskobik yöntemleriyle karşılaştırılması amaçlanmıştır. Layşmanyazis şüpheli hasta lezyonlarından yara sıvısı örnekleri lam üzerine alınıp, tespit edilerek Giemsa boyasıyla boyanmıştır. Preparatlar mikroskopta incelenip amastigot pozitifliği yönünden değerlendirilmiştir. Giemsa boyalı preparatlardan, QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak DNA ekstraksiyonu yapıldıktan sonra örnekler, LITSR ve L5.8S primerleri kullanılarak Sybr Green bazlı ITS-1 Rt-PCR yöntemiyle çalışılmıştır. Çalışmada PCR sonuçlarına göre,erime eğrisi analizi yapılmış ve erime eğrileri referans suşlarla karşılaştırılmıştır. Daha sonra, yüz otuz altı örneğe ITS1 bölgesi amplifikasyonu için LITSR ve L5.8S primerleri kullanılarak PCR uygulanmıştır. Elde edilen PCR ürünleri Hae III restriksiyon enzimiyle kesilerek “restriction fragment length polymorphism (RFLP)” yapılmıştır. Ürünler metaphor agaroz jelde yürütüldükten sonra jeller 15 dakika etidyum bromür ile boyanıp, ultraviyole (UV) transilüminatörde görüntülenmiştir. Çalışmamızda Sybr Green bazlı ITS-1 Rt-PCR, ITS-1 PCR- RFLP ve direkt mikroskopi yöntemlerinin sonuçları kullanılarak karşılaştırma yapılmıştır. En yüksek pozitiflik oranı %97 (136/132) olarak ITS-1 Rt-PCR ile belirlenmiştir. ITS-1 PCR- RFLP %95.5 (136/130) ve direkt mikroskopi ile %94.1 (136/128) oranında pozitiflik saptanmıştır. Sybr Green bazlı ITS-1 Rt-PCR yöntemiyle çalışılıp pozitif bulunan 132 örneğin, erime eğrisi analiziyle 121’i Leishmania tropica, 11’i Leishmania major olarak tiplendirilmiştir. ITS-1 PCR RFLP ile çalışılan 130 örneğin 119 (%91.5)’unun L.tropica, 11 (%8.5)’inin ise L.major olduğu belirlenmiştir. Çalışmamızda kullandığımız ITS-1 Rt-PCR yöntemi en fazla pozitiflik saptayan yöntem olmuştur. Bu yöntemle Leishmania örnekleri L.tropica ve L.major olarak tiplendirilmiştir. PCR sonrası kesim, boyama gibi ekstra işlemler gerektirmemesi ve kısa sürede sonuç vermesi bakımından bu yöntemin Leishmania parazitinin varlığını tespit etmesi ve Leishmania türlerinin hızlı tanımlanmasında faydalı olabileceği ancak L.tropica ve L.major dışındaki türlerin saptanmasında etkinliğinin görülebilmesi için yeni çalışmalar yapılması gerektiği düşünülmüştür.

Abstract

Cutaneous leishmaniasis (CL) is an important public health problem, most frequently seen in Şanlıurfa in Turkey. It is important to determine the species in regions where infection occurs with different Leishmania species, as in our province. In this study, it was aimed to genotype 136 samples with suspected Leishmania from Şanlıurfa using the Sybr Green-based ITS-1 real time polymerase chain reaction (Rt-PCR) method and then to compare them with ITS-1 PCR RFLP and direct microscopy methods. Wound fluid samples from patient lesions suspected of leishmaniasis were mounted on a slide, fixed, and stained with Giemsa dye. The preparations were examined under the microscope and evaluated for the presence of amastigote. After the extraction of DNA from Giemsa stained preparations by using the QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany), the samples were studied with the Sybr Green based ITS-1 Rt-PCR method using LITSR and L5.8S primers. As a result of the PCR study, melting curve analysis was determined and the melting curves were compared with the reference strains. Then, PCR was performed in 136 samples for ITS1 region amplification using primers LITSR and L5.8S. PCR products were digested with Hae III restriction enzyme and RFLP process was performed. The products were run on metaphor agarose gel than the gels were stained with ethidium bromide for 15 min and visualized in a UV transilluminator In our study, the results of Sybr Green-based ITS-1 Rt-PCR, ITS-1 PCR-RFLP and direct microscopy methods were compared. The highest positivity rate was determined as 97% (136/132) in ITS-1 Rt-PCR method. With ITS-1 PCR-RFLP method 95.5% (136/130) positivity and with direct microscopy 94.1% (136/128) positivity were obtained, respectively. Of 132 samples, which were studied with the Sybr Green-based ITS-1 Rt-PCR method and found as positive, 121 were genotyped as L.tropica and 11 were genotyped as L.major by melting curve analysis. It was determined that, of 130 samples studied with ITS-1 PCR RFLP method 119 (91.5%) were detected as L.tropica and 11 (8.5%) were detected as L.major. The ITS-1 Rt-PCR method we used in our study was the method that detected the most positivity rate. With this method, Leishmania specimens were typed as L.tropica and L.major. It is thought that this method may be useful for the detection of the presence of Leishmania parasite and in the rapid identification of Leishmania species, as it does not require extra processes such as cutting and staining after PCR and results in a short time, but new studies are needed to observe its effectiveness in detecting other species other than L.tropica and L.major.