Pelajik ve Bentik Balıklarının Solungaçlarından Saflaştırılan Karbonikanhidraz Aktivitelerinin İrdelenmesi

Investigation of Purified Carbonic Anhydrase Activity from The Gills of Pelagic and Benthic Fish

Özet

Bu çalışmada, denizel ortamda bentik bölgede yaşayan Mezgit ve pelajik bölgede yaşayanHamsi balıklarının solungaçlarından karbonik anhidraz (CA) saflaştırıldı ve karakterize edildi.Mezgit balığı solungacından elde edilen CA enzimi, Sepharose-4B-L tirozin-sülfanilamid afinitekolonunda 14 kat ve %19,5 verimle saflaştırıldı. Hamsi balığı solungacından elde edilen CAenzimi ise 17 kat ve %9,5 verimle saflaştırıldı. Mezgit ve Hamsi balıklarının özgül aktivitelerisırasıyla 126,4 EU mg protein-1 ve 1000,0 EU mg protein-1 olarak belirlendi. SDS-PAGElektroforezi sonucunda her iki balığın solungaçlarından saflaştırılan karbonik anhidrazlarınaltbirim molekül kütlesi yaklaşık 29 kDa olan tek protein bantlarına sahip oldukları belirlendi.Solungaçlarından elde edilen CA’ların p-nitrofenil asetat substratı varlığında esteraz aktiviteleripH 8,0’da ve 40 oC sıcaklıkta en yüksek olduğu belirlendi. Mezgit ve Hamsi balıklarınınsolungaçlarından saflaştırılan CA’ nın, p-nitrofenol asetat substratı varlığında Km ve Vmaksdeğerleri Lineweaver-Burk grafiğiyle hesaplandı ve sırasıyla Km değeri 0,08 mM ve 0,01 mM,Vmaks değeri 1x107 µM dak-1 ve 2,5x106 µM dak-1 olarak tespit edildi. Mezgit ve Hamsibalıklarının solungaçlarından elde edilen CA’ nın sırasıyla sülfanilamid inhibitörü varlığında 6,0µM ile 4,0 µM ve asetazolamid inhibitörü varlığında ise 2,0 µM ile 2,0 µM IC50 değerlerine sahipolduğu tespit edildi.

Abstract

In this study, carbonic anhydrase (CA) was purified and characterized from the gills of anchovy fish living in the pelagic region and whiting living in the benthic region in marine environment. The carbonic anhydrase from the whiting gill was purified 14 fold and 19.5% yield using Sepharose-4B-L tyrosine-sulfanilamide affinity column. Also, carbonic anhydrase from the anchovy gill was purified 17 fold and 9.5% yield using same column. The specific activity of whiting and anchovy fish were determined as 126.4 EU mg protein-1 and 1 000.0 EU mg protein1, respectively. SDS-PAG Electrophoresis showed that the carbonic anhydrases purified from the gills of both fish had single protein bands with a subunit molecular mass of approximately 29 kDa. In the presence of p-nitrophenyl acetate substratum of gills, esterase activities were found to be highest at pH 8.0 and 40 ° C. The values of Km and Vmax of carbonic anhydrase from the gills of whiting and anchovy fish were calculated by Lineweaver-Burk graph in the presence of p-nitrophenol acetate substrate and Km values were determined as 0.08 mM and 0.01 mM respectively, Vmax value was 1x107 M min-1 and 2.5x106 M min-1, respectively. It was determined that the CA obtained from the gills of whiting and anchovy fish had an IC50 value of 6.0 μM to 4.0 μM against the sulfanilamide inhibitor, respectively and 2.0 μM to 2.0 μM, against the acetazolamide inhibitor.