Glutatyon S-Transferaz Enziminin Palamut (Sarda sarda) Karaciğerinden Saflaştırılması ve Bazı Metal İyonların Enzim Aktivitesi Üzerine Etkilerinin İncelenmesi

Purification of Glutathione S-Transferase From Bonito (Sarda Sarda) Liver And Investigation of Metal Ions Effects on Enzyme Activity

Özet

Glutatyon S-transferaz (GST, EC. 2.5.1.18) elektrofilik merkeze sahip hidrofobik bileşiklerin glutatyonla (GSH) konjugasyonunu katalizler. Sunulan bu çalışmada GST enziminin palamut karaciğerinden ilk kez saflaştırılması ve bazı metal iyonların enzim aktivitesi üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Saflaştırma işlemi homojenatın hazırlanması ve glutatyon-agaroz afinite kromatografisi olmak üzere iki basamakta gerçekleştirildi. Enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve elektroforezde çift bant görüldü. Enzimin heterodimer yapıya sahip olduğu bulundu. Ayrıca bazı metal iyonların enzim aktivitesi üzerine etkileri incelendi. İnhibisyon etkisi gösteren metal iyonlar için $IC_{50}$ değerleri % aktivite-[metal iyon] grafiğinden hesaplandı ve Ki sabitleri ve inhibisyon türleri Lineweaver-Burk grafiği kullanılarak belirlendi. $Pb^{2+}, Cr^{2+} ve Fe^{3+}$ iyonları enzim aktivitesini etkilemediği, $Co^{+2}$ iyonunun enzimi aktive ettiği, $Ag^{+}, Cu^{2+}, Cd^{2+} ve Zn^{2+}$inhibisyon etkisi gösterdiği bulundu. İnhibisyon sırası 0,166±0,046 µM; 14,6± 4,7 µM; 88,3±33,5 µM ve 1390±440 µM Ki sabitleriyle, $Cu^{+2}>Ag^{+}>Cd^{+2}>Zn^{+2}$ olarak bulundu. Bu metallerin hepsinin enzimi yarışmasız olarak inhibe ettiği tespit edildi.

Abstract

The Glutathione S-transferase (GST, EC.2.5.1.18) catalyzes the conjugation of hydrophobic compounds including electrophilic centre to the glutathione (GSH). In this study, purification of GST from bonito liver for the first time and examination of some metal ions’ effects on enzyme activity were aimed. Purification procedure was performed in two steps as preparation of homogenate and glutathione-agarose affinity chromatography. The purity of enzyme was controlled by SDS-PAGE, and it exhibited two bands. It was found as heterodimer structure. Additionally, effects of some metal ions were examined on the enzyme activity. For metal ions showing inhibitory effects, $IC_{50}$ values were calculated by Activity% [metal ion] graphs and Ki constants and inhibition types were determined via Lineweaver-Burk graphs. $Pb^{2+}, Cr^{2+} and Fe^{3+}$ ions had not any effects on the enzyme activity. Yet, while $Co^{2+}$ activated the enzyme, $Ag^{+}, Cu^{2+}, Cd^{2+} and Zn^{2+}$ showed inhibitory effect. Inhibitory order was found as $Cu^{+2}>Ag^{+}>Cd^{+2}>Zn^{+2}$ with the Ki values of 0.166 ± 0.046 µM; 0.0146±0.0047 mM; 0.0883±0.0335 mM and 1.39±0.44 mM respectively and enzyme was inhibited noncompetitively by these metals.