Hammerhead ribozim ve HIV RNA'ların REV multimerizasyonu ile Co-lokalizasyonu

Özet

Hammerhead ribozimlerin (RNA enzimleri) terapötik amaçla uygulanabilmeleri için, istenilen hedefle bağlanmaları şarttır, insan immünyetmezlik virüsü (HIV) infeksiyonu, virüsün env geninin ekspresyonuna bağlıdır. HIV Rev proteini; virüsün env RNA'sında bulunan karmaşık yapılı "Rev Binding Element (RBE)"e bağlanır. Ribozimleri kullanan anti-HIV gen tedavisinde; HIV mRNA'sı ile anti-HIV ribozim moleküllerinin birbirlerine bağlanma (co-lokalizasyon) olasılığını arttırmak için aşağıdaki yöntem önerilmiştir: Orjinal HIV RBE nükleotid dizisi ribozim molekülüne eklendiğinde, Rev protein monomerlerinin hem HIV genomundaki hem de ribozim + RBE füzyon molekülündeki RBE'lere eşzamanlı bağlanmaları ve müteakip multimerizasyonları ile HIV RNA ve terapötik anti-HIV ribozim RNA'ların birbirlerine bağlanma olasılığı arttırılabilir. Bu anlamda Yamada ve arkadaşları, HIV RBE molekülünü, HIV-1 RNA'sını U5 bölgesinden kesen bir Hairpin ribozime birleştirdiler. "Sadece ribozim ve ribozim + RBE füzyon molekülü" ile yaptıkları karşılaştırmalı in vivo çalışmalarında, füzyon molekülüyle antiviral aktivitede ribozime göre önemli bir artış elde ettiler. Fakat yukarıdaki fikrin çalıştığını gösteren herhangi bir in vitro bulgu rapor etmediler. Bu çalışmamızda, in vitro olarak, Rev proteini aracılığıyla terapötik ribozim ve HIV RNA'ların biraraya gelip gelmediğini araştırdık. Bu amaçla HIV env geninin, HIV infeksiyonunun yayılmasında önemli rol oynayan gpl20 ve gp4l proteinlerini doğuran kısmında, ribozimlerin bağlanabileceği en uygun yeri saptadıktan sonra buradan HIV RNA'sını kesen bir Hammerhead ribozim hazır¬ladık ve ona 3' ucundan HIV-1 RBE molekülü ekledik. Rev bağlama ve "gel shift retardation assay"lerini kullanarak Rev multimer köprüsü ile, içerisinde HIV ve ribozim RNA'ları ile Rev proteini ve RBE moleküllerini (hem füzyon RNA hem de HIV genomundaki) içeren ribonükleoprotein (RNP) komplekslerinin oluşup oluşmadığını test ettik. Sonuçlarımız, Rev protein monomerlerinin, HIV genomundaki ve füzyon molekülündeki RBE'lere eşzamanlı bağlanma ve müteakip multimerizasyonlarıyla HIV ve ribozim RNA'larını biraraya getirebileceğini ve bu yöntemin ribozimlerin antiviral etkisini arttırmada etkin bir rol oynayabileceğini göstermek¬tedir.

Abstract

To effectively apply Hammerhead ribozymes as therapeutic agents it is necessary to co-localizexhem with the desired target. Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infectivity is dependent on envgehe exp¬ression. HIV-1 Rev protein binds to a higher ordered RNA structure within the env transcript termed the Rev Binding Element (RBE). In anti-HIV gene therapy employing ribozymes to increase the co-localization of anti-HIV ribozymes with target HIV mRNAs, it has been proposed that when the native HIV-1 RBE is appen¬ded to a ribozyme as a decoy molecule, simultaneous binding of Rev monomers to the RBE sequences in both HIV-1 genome and in the ribozyme-RBE fusion molecule and their subsequent multimerization may ser¬ve to increase the co-localization of ribozyme with HIV-1 mRNA. In this respect, Yamada et al; have combi¬ned the native HIV-1 RBE sequence with a Hairpin ribozyme targeted to the U5 region of HIV-1. Their da¬ta have demonstrated a substantial enhancement of antiviral activity in vivo when both RBE and ribozyme were present in comparison to either one alone. But their studies never demonstrated co-localization in vit¬ro. In this study we have tested the concept of Rev mediated co-localization in vitro. After detection of the most accessible sites for Hammerhead ribozymes targeting a region of the HIV-1 envgene encoding gp 120 and gp41 proteins, we designed anti-env Hammerhead ribozymes against these sites and fused them with the native HIV-1 RBE sequences. Using Rev binding and gel shift retardation assays we have tested whether or not RNP complexes which include Rev, the RBE, ribozyme and the HIV-1 mRNA are formed as a result of Rev multimerization. Our results here demonstrate that simultaneous binding of Rev monomers to the RBE sequences in both HIV-1 genome and in the fusion molecule and their subsequent multimerization can co-localize ribozyme and target RNAs and that this method can be effective in the enhancement of ribozyme's antiviral activity.