Metisiline Duyarlı ve Dirençli Staphylococcus aureus İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Özelliklerinin Konvansiyonel ve Moleküler Yöntemlerle Belirlenmesi

Determination of Biofilm Formation Properties of Methicillin Sensitive and Resistant Staphylococcus aureus Isolates by Conventional and Molecular Methods

Özet

Biyofilm kaynaklı enfeksiyonlar günümüzde en önemli tedavi başarısızlığı nedenlerinin başında gelmektedir. Biyofilm kaynaklı enfeksiyonların en sık etkenlerinden biri Staphylococcus aureus’tur. Biyofilmkaynaklı enfeksiyonlar bakterideki metisilin direnciyle birleştiğinde uygun tedavi protokolü belirlemekson derece güçleşmektedir. Çalışmada farklı klinik örneklerden izole edilmiş metisiline duyarlı ve dirençliS.aureus’ların biyofilm oluşturma potansiyelini gözlemlemek; biyofilm tespitinde kullanılacak güvenilirve etkin yöntemleri belirlemek amaçlanmıştır. Klinik ve laboratuvar bulgular karşılaştırılarak etken olarakkabul edilen 107 adet yara, 93 adet kan ve kateter örneğinden izole edilmiş toplam 200 S.aureus izolatı(100 adet metisiline dirençli, 100 adet metisiline duyarlı) çalışmaya dahil edilmiştir. Metisilin duyarlılığının tespitinde otomatize sistem ile elde edilen oksasilin minimum inhibitör konsantrasyonu değerive sefoksitin disk difüzyon yöntemleri birlikte değerlendirilmiştir. Bakterilerin biyofilm oluşumu modifiyeChristensen (MC), MTT, BioTimer ve Kongo kırmızısı agar (KKA) yöntemleri ile incelenmiş, ayrıca biyofilmoluşumundan sorumlu ica operonu varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile araştırılmıştır. MC, MTTve BioTimer yöntemlerinin tümünde metisiline dirençli izolatların duyarlı izolatlara göre daha kısa süredeve yüksek oranda biyofilm oluşturduğu, oluşturdukları biyofilm yapısının daha yoğun olduğu gösterilmiştir. Kan ve yara izolatları arasında biyofilm oluşumu açısından bir fark bulunmamıştır. Konvansiyonelyöntemlerden en duyarlı yöntemin MTT; en özgül yöntemin BioTimer yöntemi olduğu görülmüştür. PCR ile icaADBC operonuna ait bir gen bölgesini içeren izolatlarla MC, MTT, BioTimer, KKA yöntemlerine görebiyofilm oluşturan izolatlar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Tespit edilen biyofilm varlığı ile icapozitifliği arasında yüksek korelasyon bulunduğu, ica gen sayısı arttıkça biyofilm oluşturma eğilimininarttığı görülmüştür. Metisiline dirençli S.aureus gibi daha virülan izolatların biyofilm oluşturma eğiliminindaha yüksek olduğu ve bu iki direnç mekanizmasının birbirini kaskat şeklinde destekler nitelikte olduğugörülmüştür. ica tespitinin tek başına bile virülan izolatların belirlenmesinde önemli bir ayıraç olabileceğivurgulanmış, böylece tedavi kararlarının alınmasında, korunma stratejilerinin belirlenmesinde ve biyofilmkaynaklı enfeksiyonlarla mücadelede erken bir belirteç olabileceği görülmüştür. Moleküler yöntemlerinkullanılamadığı durumlarda biyofilm varlığının tespitinde kullanılacak hızlı sonuç veren, kolay uygulanabilir ve güvenilir konvansiyonel yöntemlerin varlığı son derece önem taşımaktadır. Çalışmamızda kullanılantüm konvansiyonel yöntemler bu açıdan yeterli gözükmektedir. MC ve MTT yöntemleri biyofilm kantitasyonu da yapması açısından ön plana çıkmaktadır. BioTimer yöntemi ise biyofilm varlığının tespitindekullanılan çok yeni ve dikkat çekici bir testtir. Sonuç olarak kolonizasyon veya enfeksiyon etkeni olarakbelirlenen bakterilerin biyofilm oluşturma potansiyelini belirlemek ve girişimsel işlemlerden önce bu bakterilere yönelik gereken tedbirleri almak biyofilm kaynaklı enfeksiyonları ve bunlara bağlı morbidite vemortaliteyi azaltacaktır.

Abstract

Biofilm-related infections are considered as among the foremost causes of treatment failure nowadays. One of the most common causes of biofilm-related infections is Staphylococcus aureus. It becomes extremely difficult to determine the appropriate treatment protocol while biofilm-related infections are coexisting with bacterial methicillin resistance. The aim of this study was to observe the potential of biofilm formation of methicillin-sensitive and -resistant S.aureus strains isolated from different clinical specimens and to determine reliable and effective methods for biofilm detection. A total of 200 S.aureus strains (100 methicillin-resistant and 100 methicillin-susceptible) isolated from 107 wound, 93 blood and catheter specimens, which were accepted as causative agents, included in the study. In order to determine the methicillin sensitivity, oxacillin minimal inhibitory concentration value obtained by an automated system and cefoxitin disc diffusion method were evaluated together. Biofilm formation was investigated by modified Christensen (MC), MTT, BioTimer and Congo Red Agar (CRA) methods, and the presence of ica operon responsible for biofilm formation was also observed by polymerase chain reaction. It has been shown that methicillin-resistant isolates produce biofilms in a shorter time and higher rate, and their biofilm structure is denser than methicillin-sensitive isolates in all MC, MTT and BioTimer methods. There was no difference between blood and wound isolates in biofilm formation. The most sensitive and specific conventional methods were MTT and BioTimer methods respectively. There was no significant difference between the isolates containing a gene region of icaADBC operon and the biofilm forming isolates according to MC, MTT, BioTimer and CCA methods. There was a high correlation between the presence of biofilm and ica positivity, and the tendency to form biofilm augmented as the number of ica genes increased. It has been emphasized that more virulent strains such as methicillin-resistant S.aureus have a higher tendency to form biofilm, and these two resistance mechanisms have been shown to support each other as cascade. ica detection may be an important reagent in itself for the detection of virulent strains, thus detection of the ica presence may be an early marker of treatment decisions, determination of protection strategies, and struggle with biofilm-related infections. In cases where molecular methods are not available, the existence of quick, easy-to-apply and reliable conventional methods to detect biofilm formation is extremely important. All conventional methods used in this study seem to be sufficient in this respect. MC and MTT methods stand out in terms of biofilm quantitation. BioTimer method is a very new and remarkable test used to detect biofilm formation. In conclusion, determining the potential of biofilm formation of colonizing or causative agents and taking essential precautions before interventional procedures will decrease biofilm related infections and related morbidity and mortality.