Dergiler / Flora İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Dergisi / 2018 / Cilt: 23 - Sayı: 3
Aspergillus DNA’sının Klinik Örneklerde Gösterilmesine Yönelik Geliştirilen Kalitatif Gerçek Zamanlı PCR Yönteminin Kalite Kontrolü
- Sayfa
- 108–115
- DOI
- —
Özet
Giriş: Aspergillus cinsi küf mantarlarının klinik örneklerde kültürde üretilme başarısı %50’yi geçmemektedir. Nötropenik ateş dönemindeki hastaların bir çoğunda ampirik antifungal tedavi başlanması nedeniyle, kültürde herhangi bir mantarın üretilebilme olasılığı azalmaktadır. Moleküler yöntemlerde hedeflenen mikroorganizmanın DNA’sı gösterildiği için tedavi başlanmış olması tanıyı olumsuz yönde etkilememektedir. Bu çalışmada, Aspergillus cinsi mantarların DNA’sının gösterilmesi için geliştirilen kalitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi sunulmuştur. Materyal ve Metod: Örneklerden DNA izolasyonu hazır sistem kullanılmadan yapılmıştır. Aspergillus cinsi mantarların rDNA gen bölgesinden 28S alt ünitesi hedeflenmiş, TaqMan amplifikasyon gerçekleştirilmiştir. Yöntemin aspergillozdaki tanısal değeri farklı örnekler kullanılarak incelenmiştir. Aspergillus kolonisi ile kontamine edilen “simüle” kan örnekleri, aspergilloz oluşturulan deney hayvanı kan ve dokuları ve aspergilloz şüphesiyle takip edilen hasta örnekleri ile toplam 60 örnek çalışılmıştır. Bulgular: En çok yalancı negatiflik deneysel olarak aspergilloz oluşturulmuş hayvanların doku örneklerinde elde edilmiştir. Hayvan doku örneklerinin 4 (%40)’ünde, hayvan kan örneklerinin 3 (%30)’ünde, simüle kan örneklerinin 2 (%20)’sinde, hasta örneklerinin 1 (%10)’inde yalancı negatif sonuç alınmıştır. Koloni süspansiyonlarının tamamı pozitif bulunmuştur. Sonuç: Geliştirdiğimiz yöntemin kan örneklerinde Aspergillus DNA’sının gösterilmesinde başarılı olduğu ancak, doku örnekleri için geliştirilmesi gerektiğine karar verilmiştir. Yöntemin tanısal değerinin geniş gruplarda yapılacak çalışmalar ile desteklenmesi gerekmektedir.
Abstract
Introduction: The culture of clinical samples is positive in only 50% of the aspergillosis cases. In most neutropenic fever patients, antifungal treatment is generally commenced based on empirical considerations and reduces the growth rates in microbiological cultures. Polymerase chain reaction (PCR) screening for circulating DNA is not related to treatment in order for the DNA to be detected under antifungal effect. We evaluated the utility of qualitative real time PCR assay for the detection of Aspergillus DNA. Materials and Methods: DNA isolation was performed without a commercial system. The presence of DNA from the samples was detected using TaqMan PCR targeting fungal 28S rDNA gene. Diagnostic approach of the assay was evaluated by using different samples. Sixty samples including blood samples contaminated with Aspergillus conidia, colony suspensions, tissue and blood samples of experimentally infected animals, and patient samples obtained from suspected cases were subjected to testing. Results: False negative results were obtained from tissue samples of experimentally infected animals. When the results were analysed, 4 (40%) of the tissue samples, 3 (30%) of the blood samples, 2 (20%) of the simulated blood samples, and 1 (10%) of the patient samples failed to achieve the same level of detection. Colony suspensions were found to be all positive (100%). Conclusion: The efficiency of the Aspergillus PCR is limited in tissue samples, but sufficient in blood samples, and should be qualified to exclude false negativity. Clinical studies with large number of samples should be initiated to integrate PCR in the diagnostic armentarium of aspergillosis.